RNA isolation 과 DNA extraction 실험을 진행을 하고 있는 대학원생 입니다. 실험하는 과정에 있어서 질문이 있어서 글을 올렸습니다. 교수님께서 RNA 와 DNA를 뽑을때 같은날에 같이 뽑아야 된다고 말씀을 해주셨는데 서로 동일한 조건을 주기 위해서 그렇게 실험을 하는것인지 아니면 다른이유가 있는지 궁금합니다.

이 분야를 해본적도, 배경 지식도 하나도 없는데.. 갑작스레 해야하는 상황입니다. 하아.... protocol을 찾아보려고 아무리 검색해봐도 논문정도밖에 없네요. 참고 가능한 protocol 갖고 계시면 도움 부탁드립니다.  

안녕하세요   저는 석박통합 1학기차 대학원생입니다.   저는 주로 293T와 HeLa cell을 culture하고 있는데   cell split과 관련해서 여쭤볼 것이 있어서 글을 쓰게 되었습니다.   일단 석션으로 DMEM을 다 빼낸 후   DPBS 3ml 정도로 cell을 wash하고 다시 석션으로 빼고   이후 trypsin 1ml를 처리했습니다. trypsin을 처리한 이후 10cm cell culture dish에 9ml DMEM을 넣고 trypsin 처리한 culture dish에 DMEM 2ml를 넣어서 1:3 split을 한 뒤 거기에서 1ml를 따서 9ml DMEM에 넣는 방식으로 split을 했습니다.   그런데 cell seeding을 할 때 cell이 골고루 잘 퍼지지가 않는 것이 고민입니다. 한 쪽은 cell이 꽉 차있고 어느 쪽은 좀 비어있을 때가 있더라고요 어떻게 하면 cell을 골고루 seeding 할 수 있는지 여쭙고 싶습니다. 그리고 trypsin 처리를 하고 좀 놔두면 cell이 좀 떡이진다고 해야할까요 뭔가 죽은 cell이 둥둥 떠나니는 것 같기도 하고 그렇습니다. cell이 성장하는데 는 문제도 없고 컨템은 아닌 것 같은데 왜 그런 건지 여쭙고 싶습니다.

선배님들 안녕하세요.  요즘 electroporation을 위한 DH5a comp. cell을 제작하고 있는 학생입니다. DH5a cell (wild type) 전배양액을 1% 접종한 50ml의 본배양액을 6000 xg 4도씨에서 centrifugation을 진행하여 harvest 했습니다. 그런데, DH5a의 pellet이 흰색이 아니라 사진과 같은 검정색부분이 많이 보이더라구요. 구글링으로 찾아봤는데, "오염이다." 라는 의견이 많지만 아니라고 하는 의견도 있더군요.  plate 상에서 colony는 별 문제 안보이는데, 선배님들은 어떻게 생각하시는지 궁금합니다. 물론 다시 배양해서 다른 방식으로 진행하고 있지만 궁금해서 질문합니다!

안녕하세요! exosome을 Flow cytometry 하려고 합니다! 공부를 해보니, exosome은 크기가 작아 bead를 붙여서 flow cytometry 한다고 하더라구요! 그래서 exosome capture beads를 구매하여 진행할 계획입니다.   제가 궁금한 것은, beads로 exosome을 capture한 후에, 그 exosome membrance에 loading 되어있는 protein을 검출하기 위해 antibody를 붙이는데, 찾아보니 제가 원하는 단백질(HB-EGF 입니다!)을 검출하는 FC용이 없더라구요 ㅠㅠ!! 브릭에 검색해보니 Flow cytometry가 되면 IC(immunoflouresence)가 된다고 하는데, IC가 되면 FC가 되진 않는건가요?? 또, conjugated antibody면 FC가 된다고 하는데 맞는것인지 잘 모르겠습니다..ㅠㅠ 아직 초보 학생이라 모르는게 많습니다..ㅠㅠ 고수님들 조언 부탁드립니다..ㅠㅠ!!!!

2.94mg solid, 8503 units/mg solid 로 24998.82 (= 25KU)인 sigma사의 tyrosinase from mushroom을 구매했습니다. Tyrosinase 저해활성을 통한 미백효과 in vitro 실험을 진행중에 있습니다 제가 unit에 대한 개념이 부족하다보니 제가 가진 unit의 enzyme을 2,500units/mL로 희석하는 방법에 어려움을 겪고 있습니다.. 조금 검색을 해보니 필요 24998.49/2500 -> 9.999528mL buffer(pH6.5 100mM sodium phosphate buffer)로 희석하여 사용하면 된다고 하던데, 그럼 enzyme 전량을 버퍼에 희석하면 되는건가요? 희석후 엘리컷하여 -70도에서 보관하며 사용할 계획입니다. 제가 계산한대로 약 10mL의 버퍼(9.999528mL)에 enzyme 전체를 희석하면 2500unit의 enzyme 10mL 가량을 얻을 수있는건지 확인 부탁드리겠습니다.

gibson cloning 하기 전 pcr을 하여 gel purification을 하려하는데 pcr에서 진전이 되지 않습니다.. 사이즈는 6kb이며 pcr condition 53,55,58도로 다 해봐도 나오지 않습니다.. dmso 1ul mgcl2 0.5ul 넣어서 gc/hf 버퍼 사용했을때도 나오지 않구요.. 프라이머에는 문제가 없는데 고수님들 구합니다..

안녕하세요. 올해부터 실험실에서 연구를 배우고 있는 새내기입니다.   다름아니라 제가 아직 개념이 없어서 질문을 좀 드리려고합니다. 제가 cancer cell line들로 실험을 하려는데, 이 cell line들에 barcoding(26 nucleotides in length)를 넣으려고 합니다.  그래서 제가 계획한 방법은,  1) 회사에 원하는 barcoding sequence를 제작해달라고 요청. 2)이 barcoding sequence를 lentivirial vector에 삽입하여 cloning. 3) 준비된 lentivirus를 cell에 infection 시킨다.  Q1. 이 실험방법이 맞나요? Q2. 1)의 barcoding을 lentivirus에 넣는 protocol이 있을까요??  Q3. lentivirus에 luciferase도 같이 넣으려고 하는데, 이건 어떻게 준비를 해야되는건가요? lentivirus 자체가 luciferase를 가지고 있는 lentivirus를 준비해야되는건지, 아니면 lentivirus에 luciferase 도 따로 넣어줘야되는건지...  제가 개념이 없어서; 두서가 없는데, 고수님들 답변부탁드립니다. 

안녕하세요 이번에 새로운 주제로 마이크로칩을 다루게 되었습니다. PDMS 로 micro chip을 제작하고 안에 고분자 재료들로 칩을 구성하였습니다. 당연히 master mold - soft lithography 후에 플라즈마로 glass와 bonding하였구요   후에 멸균과정에서 문제가 있는 것 같은데 지금까지는 내부를 70% 에탄올로 소독 DI 로 washing후에 clean beanch UV에서 overnight합니다. 이후 PDL을 넣어주고 인큐베이터에서 3시간이상 후 다시 DI 로 washing후 오븐에서 건조합니다.   여지껏 이상이 없었는데 새로운 SH-SY5Y 세포를 chip 안에서 키우려하니 너무 다릅니다.   같은 시간대에 culture dish에 배양과 micro chip에서의 배양을 봤더니 세포크기도 다르고 (쪼그라들었음) 합니다.   PDL의 문제일까요? 아니면 SH-SY5Y 세포가 PDMS에서 배양하기 힘든가요? collagen coating을 시도해 봐야하나 고민입니다....   다른 논문들을 찾아봐도 실험적인 protocol들은 적다보니 이를 해결하기가 난해합니다. 멸균 문제라고도 생각하는데 혹시 PDMS based microchip의 멸균은 어떻게들 하시나요?? (참고로 고분자가 포함되지 않은 microchip은 autoclave에서 멸균하였음에도 같은 상황)   질문이 너무 많네요... 1) PDL protocol이 이상한가요? 2) clean beanch UV에서 제작이 완성된 microchip 내부 채널까지멸균이 가능한가요? 3) 멸균할 다른 방법은 또 없을까요?   정도가 될 것 같습니다. 긴 글 읽어주셔서 감사합니다.

제가 이해를 잘 한건지 몰라서 protocol 확인좀 부탁드립니다. 첫 번째!! 제가 이전에 올렸던 질문에서 누군가 답변해주시기를 사용하는 Primer의 농도는 저기에 적힌대로 희석시 300-800nM이 되면 된다고 하던데, 보통 Primer의 working solution이 10pM 기준이니 20μL 기준으로 그대로 1μL를 사용하면 최종농도는 500nM이 되는게 맞는건가요?? (10pM = 10μM = 10,000nM으로 계산했습니다.) 10μL 기준이라면 Working solution 양을 5pM로 1/2 희석을 더 진행한다음 10μL 기준으로 그대로 1μL를 사용하면 최종농도는 500nM이 되는 거고요..? 두 번째!! 저기 나온 cDNA 1-10ng이라는 것도 희석했을 때 저 농도가 되면 된다라는 의미로 해석하면 되는건가요?? 세 번째!! Total volumn 10μL랑 20μL랑 큰 차이가 있는건가요?? 20μL일 경우 양을 두 배로 사용하는 거지만 실험에 흔들리는 것들을 잡아준다고 하던데.. 이 소리를 듣고 고민이 되네요.. kit를 두배를 사용하냐 마냐니까요.. 네 번째!! annealing Tm값이 정해졌다면 Control과 처리군을 3반복 실험을 할 때, 각각 100mm dish 3개씩에 배양을 한 sample을 가지고 실험을 하는 건 알겠는데.. 여기서도 헷갈리는게 있네요.. 샘플 하나 당 3반복인지, 샘플 3개를 각각 1개씩 해서 3반복인지.. 간단한 거 같은데 한 번 머리 속에서 꼬이니 답답하네요ㅜㅜ

안녕하세요 이제 막 2달된 대학원생입니다... 저희 실험실은 cancer cell 을 주로 다루는데 이때까지 아무도 해보시지 않으신 SH-SY5Y cell 을 제가 처음으로 맡아서 하게 되었습니다.. 그래서 더더욱 공부도 더 해보고 하고있는데요.. 세포주은행에서 p.26 을 받아서 subculture 해 왔었는데 bacteria contamination이 되어서 stock 도 다 버리게 되었습니다..ㅠㅠ  심지어 같은 인큐베이터를 쓰시는 다른분의 cell 마저도 오염 되어서 죄책감이 진짜 이만저만이 아닙니다....하.... 저희 실험실에서 아무도 한번도 이런적이 없다고 하는데 왜 저만 이렇게 자꾸 세포가 오염이 되는걸까요 ㅠㅠㅠ 진짜 너무 스트레스 받네요.... 이번에 세포주은행에서 p.19 로 다시 한번 세포를 분양받았습니다.. 진짜 이번마저도 그렇게 되면 대학원 생활 어떻게 해야할지 모르겠습니다 ㅜㅜ Media, trypsin, DPBS, cell freezer 등등 필요한 것들은 다 버리고 새로 만들어서 다시 한번 해보려고 합니다... 다른분들과 하는 방법도 다 똑같은 것 같은데 대체 무엇이 문제일까요....실험 진행도 안되고 다른분한테 피해까지 끼치고 진짜 멘탈이 나가버릴것같네요... 어떻게 하면 cell contamination 을 줄이면서 심기일전 할 수 있을지.. SH-SY5Y cell 은 어떻게 cell culture 를 하면 좋을지 제가 다시 심기일전 할 수 있게 도와주세요.... 항생제 농도를 더 높여야 할지 어떨지 ㅜㅜ 여러가지 방법 등등이요!!도와주세요!!! Media 는 DMEM (low glucose) + F12 + 10% FBS + 1% P/S(항생제) + 1% non-essential amino acid 를 사용하고 있습니다. 참고로 media contamination 은 인큐베이터에 넣어보고 확인했을 시 문제는 없었습니다...

안녕하세요. Raw 264.7 cell에서 나오는 H2O2를 측정하는 실험을 진행중입니다. LPS로 먼저 activation 한후 나오는 H2O2를 형광인 amplex red로 측정하려고 하는데 해보신분이 있는지,... 참고문헌 찾아도 명확하게 나오지 않네요 프로토콜이 있으신 분이 있는지 너무 막막합니다...

안녕하세요 혼자서 근근히 실험중인 대학원생입니다. 이번에 쥐에서 myoblast를 primary culture를 하였는데 이 세포가 myoblast가 맞는건지 아리까리하여 질문을 올리게 되었습니다.   mouse myoblast의 cell line인 C2C12와 형태가 엇비슷하다 싶기는 한데 density가 높은 부분에서 보이는 형상이 영 신기하게 보입니다. 부착 전에는 빛나는 droplet 모양으로 보이고 부착 후 density가 높은 부분에선 사진과 같이 보이는데, 어떤 상태인 걸까요?   myoblst 많이 다뤄보신 분이 계시다면 조언 부탁드리겠습니다...

제가 이해를 잘 한건지 몰라서 protocol 확인좀 부탁드립니다. 첫 번째!! 제가 이전에 올렸던 질문에서 누군가 답변해주시기를 사용하는 Primer의 농도는 저기에 적힌대로 희석시 300-800nM이 되면 된다고 하던데, 보통 Primer의 working solution이 10pM 기준이니 20μL 기준으로 그대로 1μL를 사용하면 최종농도는 500nM이 되는게 맞는건가요?? (10pM = 10μM = 10,000nM으로 계산했습니다.) 10μL 기준이라면 Working solution 양을 5pM로 1/2 희석을 더 진행한다음 10μL 기준으로 그대로 1μL를 사용하면 최종농도는 500nM이 되는 거고요..? 두 번째!! 저기 나온 cDNA 1-10ng이라는 것도 희석했을 때 저 농도가 되면 된다라는 의미로 해석하면 되는건가요?? 세 번째!! Total volumn 10μL랑 20μL랑 큰 차이가 있는건가요?? 20μL일 경우 양을 두 배로 사용하는 거지만 실험에 흔들리는 것들을 잡아준다고 하던데.. 이 소리를 듣고 고민이 되네요.. kit를 두배를 사용하냐 마냐니까요.. 네 번째!! annealing Tm값이 정해졌다면 Control과 처리군을 3반복 실험을 할 때, 각각 100mm dish 3개씩에 배양을 한 sample을 가지고 실험을 하는 건 알겠는데.. 여기서도 헷갈리는게 있네요.. 샘플 하나 당 3반복인지, 샘플 3개를 각각 1개씩 해서 3반복인지.. 간단한 거 같은데 한 번 머리 속에서 꼬이니 답답하네요ㅜㅜ

안녕하세요   저는 석박통합 1학기차 대학원생입니다.   저는 주로 293T와 HeLa cell을 culture하고 있는데   cell split과 관련해서 여쭤볼 것이 있어서 글을 쓰게 되었습니다.   일단 석션으로 DMEM을 다 빼낸 후   DPBS 3ml 정도로 cell을 wash하고 다시 석션으로 빼고   이후 trypsin 1ml를 처리했습니다. trypsin을 처리한 이후 10cm cell culture dish에 9ml DMEM을 넣고 trypsin 처리한 culture dish에 DMEM 2ml를 넣어서 1:3 split을 한 뒤 거기에서 1ml를 따서 9ml DMEM에 넣는 방식으로 split을 했습니다.   그런데 cell seeding을 할 때 cell이 골고루 잘 퍼지지가 않는 것이 고민입니다. 한 쪽은 cell이 꽉 차있고 어느 쪽은 좀 비어있을 때가 있더라고요 어떻게 하면 cell을 골고루 seeding 할 수 있는지 여쭙고 싶습니다. 그리고 trypsin 처리를 하고 좀 놔두면 cell이 좀 떡이진다고 해야할까요 뭔가 죽은 cell이 둥둥 떠나니는 것 같기도 하고 그렇습니다. cell이 성장하는데 는 문제도 없고 컨템은 아닌 것 같은데 왜 그런 건지 여쭙고 싶습니다.

gibson cloning 하기 전 pcr을 하여 gel purification을 하려하는데 pcr에서 진전이 되지 않습니다.. 사이즈는 6kb이며 pcr condition 53,55,58도로 다 해봐도 나오지 않습니다.. dmso 1ul mgcl2 0.5ul 넣어서 gc/hf 버퍼 사용했을때도 나오지 않구요.. 프라이머에는 문제가 없는데 고수님들 구합니다..

안녕하세요! exosome을 Flow cytometry 하려고 합니다! 공부를 해보니, exosome은 크기가 작아 bead를 붙여서 flow cytometry 한다고 하더라구요! 그래서 exosome capture beads를 구매하여 진행할 계획입니다.   제가 궁금한 것은, beads로 exosome을 capture한 후에, 그 exosome membrance에 loading 되어있는 protein을 검출하기 위해 antibody를 붙이는데, 찾아보니 제가 원하는 단백질(HB-EGF 입니다!)을 검출하는 FC용이 없더라구요 ㅠㅠ!! 브릭에 검색해보니 Flow cytometry가 되면 IC(immunoflouresence)가 된다고 하는데, IC가 되면 FC가 되진 않는건가요?? 또, conjugated antibody면 FC가 된다고 하는데 맞는것인지 잘 모르겠습니다..ㅠㅠ 아직 초보 학생이라 모르는게 많습니다..ㅠㅠ 고수님들 조언 부탁드립니다..ㅠㅠ!!!!

  안녕하세요, 현재 석사 1년차이며 작년부터 cancer cell에 anticancer reagent를 처리한 후 annexin/PI 염색으로 apoptosis를 확인하는 실험을 하고 있습니다.   다름이 아니라 몇 달 전부터 사진처럼 reagent 처리 안 한 control의 apoptosis가 심하게 나오는데 원인을 잘 모르겠습니다...반 년전에 원래 실험하던 다른 cell line의 annexin 결과가 사진보다 심해서, 계대 수가 적은 다른 cell stock을 사용하고, annexin과 PI 양을 바꿔서 처리하기도 했지만 결국 잘 되지 않아 현재 cell line으로 바꾸었습니다. 바꾼 cell line은 당시 Q3 값이 90은 나왔었는데, 그런데 지금은 그때와 같은 cell line인데도 control의 Q3가 80도 채 되지 않습니다.   제가 평소에 cell maintain을 잘못 해서 점점 cell이 약해진 건지, cell plating을 할 때 cell에 damage가 간 건지, sample을 준비할 때 trypsin 처리나 resuspension 단계에서 cell이 터져서 그런 건지, sample 준비 시간이 오래 걸리는 건지...여러 가지 원인을 생각하고 있지만 확실하게 와 닿는게 없습니다.   혹시 annexin을 많이 해 보셨거나 저 같은 문제를 겪었던 적이 있으시다면, 둘 다 아니더라도 괜찮으시다면 조언을 부탁드립니다...감사합니다...      

2.94mg solid, 8503 units/mg solid 로 24998.82 (= 25KU)인 sigma사의 tyrosinase from mushroom을 구매했습니다. Tyrosinase 저해활성을 통한 미백효과 in vitro 실험을 진행중에 있습니다 제가 unit에 대한 개념이 부족하다보니 제가 가진 unit의 enzyme을 2,500units/mL로 희석하는 방법에 어려움을 겪고 있습니다.. 조금 검색을 해보니 필요 24998.49/2500 -> 9.999528mL buffer(pH6.5 100mM sodium phosphate buffer)로 희석하여 사용하면 된다고 하던데, 그럼 enzyme 전량을 버퍼에 희석하면 되는건가요? 희석후 엘리컷하여 -70도에서 보관하며 사용할 계획입니다. 제가 계산한대로 약 10mL의 버퍼(9.999528mL)에 enzyme 전체를 희석하면 2500unit의 enzyme 10mL 가량을 얻을 수있는건지 확인 부탁드리겠습니다.

  안녕하세요, 현재 실험실에서 분리균주를 이용하여 Protease / DNase enzyme activity test를 진행중인 석사 1년차 대학원생입니다.   식품에서 분리한 분리균주를 가지고 DNase test를 진행하고자 하는데요. 실험실에 보유중인 DNase agar에 분리균주를 배양하여 test를 진행하였습니다. 하지만 실험을 진행하며 실험 방법이 잘못된거같아.. 조언을 여쭙고자 글 남기게되었습니다.   실험 방법은 다음과 같습니다. 1. DNase agar에 분리균주를 24-48hr 배양한다. 2. agar에 균주가 자라면 1N HCl을 표면에 뿌려 변화를 관찰한다. 일반적인 실험결과) Positive : hydrolysis가 진행되어 colony 가장자리에 clear zone 형성 Negative : 아무것도 관찰되지않음.   약 20개 균주를 agar에 배양해보았는데, 미세하게 clear zone이 형성되는 몇몇 균주빼고는 아무 반응이 일어나지않았습니다. 균주는 plate에서 키우다가 broth에 배양한 균주를 가지고 DNase agar에 loop를 이용하여 배양하였습니다.   여기서 궁금한 점은.. 아래와 같습니다.   1N HCl을 사용하지않는 방법으로는, indicator로서 agar에 toludine blue, methylene blue를 넣어줄 경우에는 hydrolysis가 일어남과 동시에 배지 색이 변한다고 논문에서 보았는데요. 혹시 이 방법을 사용하는것이 더 나을까요?   아주 단순한 실험인듯한데.. 무엇이 잘못되었는지 조금이나마 조언 듣고자 글 남깁니다. 읽어주셔서 감사합니다