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BioLab 한창석 교수
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실험Q&A - 전체 (오늘 3건) 질문/투표/프로토콜 등록
Q. CRISPR KI때 cleavage site와 HA의 위치 관련
 gene editing으로 donor vector의 gene을 KI하는 실험을 하고 있습니다. 여태까지는 ZFN vetor (R/L), ZFN donor vector에 원하는 gene을 nuclofection으로 잘 넣어왔습니다. addgene에서 받은 vector이고, HA는 각 800 bp가 조금 넘습니다.  최근에는 ZFN 대신 Crispr/Cas system으로 KI을 전환하려고 합니다. 여태 써왔던 동일한 target에 ZFN R/L 대신 gRNA+Cas9을 RNP로 넣고, donor vector를 그대로 쓰려고 합니다. 그런데 ZFN 때는 딱 cleavage 양 옆으로 HA이 맞아 떨어졌는데, CRISPR cut site는 11bp 정도 떨어져있더라구요. 이 경우에도 제대로 KI이 될지? 경험자분의 의견을 여쭈어봅니다. 그리고 off-target이 적은 target sequence가 하나 더 있는데, 이 경우에는 아예 170 bp 정도 떨어져있습니다. 이 쯤되면 그냥 HA을 새로 design하는게 나을까요? 사실 저희 연구실과 제가하는 일은 gene editing과는 관계없는 곳이라, 가능하면 addgene에서 받은거에 최소한의 일만 하고 싶어서요.    미리 답변에 감사드립니다.   
회원작성글 GATA3  |  05.17
Q. SV40 ori 와 293 T cell의 관련성
안녕하세요, Molecular cloning을 새로 공부하는 입장에서 궁금한 점이 있어서 질문드립니다.  Lentivirus를 활용한 Molecular cloning 과정에서 293 T cell의 정확한 역할을 알고 계신 분이 있으실까요? 먼저, 제가 알기로는, Transfer vector / packaging vector, envelope vector를 co-transfection해서 viral production을 위한 packaging cell로의 역할을 한다고 알고 있습니다. 제가 궁금한 점은 293 T cell이 가지는 SV40 large t antigen의 역할입니다. SV40 ori를 가지는 plasmid를 복제할 수 있다고 하는데, 그렇다면 transfer vector에는 항상 SV40 ori를 가지게 만들어야 하는 것일까요? 아니면 SV large t antigen은 그냥 부가적인 역할인가요? (넣지 않아도 상관없을까요?) 제가 만들려는 vector는 E.coli ori를 가지게 만들어, E.coli에서 replicate한 후 transfection하는 과정을 거치려고 하는데, 이렇게 되면 293 T cell에서 SV40 large t antigen은 어떤 역할을 하는지, 역할을 하지 않아도 상관없는지 궁금합니다. 감사합니다!
회원작성글 민석장군  |  05.17
Q. Sio2 표면에 bonding된 APTES 제거하는 방법
안녕하세요. 나노레이저를 이용해 바이오물질을 센싱하는 공부를 하는 학생입니다.   레이저 캐비티가 붙은 quartz에 APTES 처리를 했는데요.   표면이 하얗게 되더라구요....   APTES 처리는 처음이라 이게 정상인가 싶어서 그 뒤로 glutaraldehyde 처리를 하고 현미경을 보니까 레이저 캐비티가 어디에 붙었는지 못알아볼 정도로 표면에 무언가 많이 붙었더라구요.   그래서 찾아보니까 APTES 처리하면서 표면처리를 깨끗하게 하지 않으면 APTES가 균일하게 코팅되지 않는다는 것을 찾았습니다.   지금 sample을 살려서 재사용해야하는터라 quartz 표면에 형성된 saline을 제거해야할거 같은데(APTES 코팅한거)   이거 작업해보신분 계신가요...?   찾아보니까 염기부터 산까지 다양한 답이 나오고 o2 plasma처리까지 해보라는 답이 있어서 경험해보신분을 찾습니다. ㅠㅠ    
회원작성글 하이린  |  05.17
Q. western blot background
안녕하세요. western blot을 하는 와중에 membrane background가 엉망으로 찍혀서 band가 제대로 보이지 않은데  위 같은 사진들처럼 band가 명확하게 나오지 않고 수많은 점박이들과 같이 detection이 됩니다... troubleshooting을 하기 위해 원인을 찾아보고 있지만 background가 저렇게 되는 경우 해결방안에 대한 부분을 찾지 못해 도움을 구하고자 합니다..   현재 의심가는 부분은 1. 1차 항체 농도가 높아서 2. 2차 항체 문제로 발생 3. X-ray 필름 상태 문제 4. blocking 제대로 되지 않아서 등으로 생각하고 있는데  western blot을 4번째 시도하고 있지만 언제는 깔끔하게 나오고 언제는 저 사진들처럼 나와서 잘 나와도 제대로 된건지 의문이긴 합니다.. 도움을 주시면 감사하겠습니다ㅠㅠ
회원작성글 96호  |  05.16
Q. 이게 뭘까요??
Pseudomonas 를  키우고 있는데 이런게 보이네요? 이건 처음보는건데 이건 뭘까요?
회원작성글 1yuja  |  05.16
Q. (고딩)흙을 물에 희석해서 배지위에 떨어트려도 되나요?
고등학생입니다. 흙에 있는 미생물을 배지에서 관찰하려고 합니다. 물에 희석해서 배지위에 떨어트리면 되나요?? 도와주세요ㅠㅠ  
회원작성글 chaechae  |  05.16
Q. 고등학교 동아리에서 지혈제 관련 실험 질문 드립니다.
지혈 효과를 직접 테스트해보고자 하는데 저희가 직접 platelet aggregation test를 진행하기엔 무리가 있어 보여서 점도와 광투과도 정도만 측정한다면 정확도가 매우 떨어지겠죠? 또, 어떠한 물질이 인체 내에서 생분해 가능하다는 건 어떤 실험을 통해서 알 수 있을까요? 아직 미숙한 학생들이라 질문드립니다. 죄송합니다
회원작성글 kdhk  |  05.16
Q. petri film사용한 E.coli 수 측정 첨부파일
미생물실험 처음하는 초짜입니다. 증류수 9ml랑 대장균1ml을 희석해 AC필름에 접종하고 24시간 후에 관찰했는데 정사각형 안에 있는 빨간 점을 보고 수를 세보고 하는 건지 어떤걸보고 어떻게 균수 산출하는지 모르겠습니다. 고수님들의 도움이 필요합니다.
회원작성글 도ㄹr지  |  05.16
Q. 중국에서 시약 사보신분 계신가요?
안녕하세요 기업연구소에 다니고있습니다 이번에 중국에서 분말을 사려고하는데 수입이 처음이라서 결제라던지 세금이라던지 절차가 어떻게 되는지 몰라서 자세히 알려주시면 감사하겠습니다
회원작성글 유차  |  05.16
Q. 가장 간소화된 mini prep kit
24개 샘플을 mini prep 으로 DNA 를 뽑을라하니 거의 3시간이 걸리더군요 물론 좀 빠르게 할려고 S1 buffer를 많이 넣어 spin column이 넘치게 되면서 한번 다시 돌리면서 시간이 늘어났긴 했지만 이게 flow-through 를 제거하는 시간이 의외로 많이 걸리네요.. 혹시 mini prep kit 중에 시간을 많이 단축가능한 것이 있는지 알려주실수 있는지요? (현재는 코스모진텍 labor pass 사용중입니다.)    
회원작성글 오미자랩  |  05.16
실험Q&A - 답변 (오늘 2건)
Q. 가장 간소화된 mini prep kit
24개 샘플을 mini prep 으로 DNA 를 뽑을라하니 거의 3시간이 걸리더군요 물론 좀 빠르게 할려고 S1 buffer를 많이 넣어 spin column이 넘치게 되면서 한번 다시 돌리면서 시간이 늘어났긴 했지만 이게 flow-through 를 제거하는 시간이 의외로 많이 걸리네요.. 혹시 mini prep kit 중에 시간을 많이 단축가능한 것이 있는지 알려주실수 있는지요? (현재는 코스모진텍 labor pass 사용중입니다.)    
회원작성글 오미자랩  |  05.16
Q. western blot background
안녕하세요. western blot을 하는 와중에 membrane background가 엉망으로 찍혀서 band가 제대로 보이지 않은데  위 같은 사진들처럼 band가 명확하게 나오지 않고 수많은 점박이들과 같이 detection이 됩니다... troubleshooting을 하기 위해 원인을 찾아보고 있지만 background가 저렇게 되는 경우 해결방안에 대한 부분을 찾지 못해 도움을 구하고자 합니다..   현재 의심가는 부분은 1. 1차 항체 농도가 높아서 2. 2차 항체 문제로 발생 3. X-ray 필름 상태 문제 4. blocking 제대로 되지 않아서 등으로 생각하고 있는데  western blot을 4번째 시도하고 있지만 언제는 깔끔하게 나오고 언제는 저 사진들처럼 나와서 잘 나와도 제대로 된건지 의문이긴 합니다.. 도움을 주시면 감사하겠습니다ㅠㅠ
회원작성글 96호  |  05.16
Q. RAW264.7 cell RT-PCR
RAW264.7 cell을 6-well plate에 well당 1*10^6개를 seeding 후 LPS 100ng/ml로 24hr 자극해 TNF-a, IL-6 발현량을 보려고합니다.  RT-PCR을 하라고 하셨는데 복학하고 이번이 첫 실험이라 프로토콜을 잘 모릅니다.. 혼자 논문이랑 책을 찾아봤는데 모델링은 어떻게 해야할지도 감이 안 잡혀서 답답하시겠지만 혹시 참고할만한 논문이나 프로토콜좀 자세히 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 파이펫도둑  |  05.16
Q. qPCR에서 housekeeping gene
안녕하세요. qPCR에서 housekeeping gene에 관해 질문이 있습니다. Housekeeping gene은 어떤 treatment에도 expression level이 잘 변하지 않는 gene이라고 알고 있는데요, 그렇다면 사람마다 housekeeping gene의 expression level은 비슷하다고 볼 수 있나요? 이를 통해, 최종적으로는 여러 사람의 blood sample에서 housekeeping gene과 target gene을 찍어서 delta Ct를 계산하는 방식이 유의미한지 궁금합니다. 만약 housekeeping gene이 사람마다 비슷하다면 그걸 target gene이 housekeeping gene의 2^(-delta Ct) 배이다. 이런 식으로 데이터를 얻을 수 있을 것 같은데,,, 사람마다 비슷하지 않아도 그 논리가 성립되나요?
회원작성글 dj_hwn  |  05.15
Q. RNase free 팁은 구매말고는 방법이 없는건가요...
저희 실험실은 신생랩인데 10년전에 구입한 것으로 추정되는 창고에 남아있던 피펫팁을 사용합니다.   RNase free 팁, RNase free water 가 RNA work에서 필요하다고 하더라구요   1.봉투하나 클린벤치 안에서 뜯어서 조심히 팁렉 안에 넣고 오토클레이브 돌리는 걸로는.... 너무 오래된 팁이라..안되겠죠??(열로 RNase를 파괴할 수 있다거나..) 2.kit 써서 RNA 추출할건데 RNase free water는 RNA 디프리저에 저장할 때 사용하는건가요??    3.RNA 저장할 때도.. RNase free micro tube가 따로 있는건가요??
회원작성글 Seoki  |  05.16
Q. 밀도를 알고 있는 상태에서 각 농도별 처리방법
안녕하세요  현재 essential oil을 가지고 실험중인 석사생입니다. 제가 사용하고자 하는 essential oil의 경우 분자량은 업체에서 100% 순도라고 하였고 확실히 아는 방법은 밀도입니다. 밀도가 0.878 이라는 물질이 있을때  100ug/mL로 만들려고 하면 어떻게 만들어야 하나요? ㅜㅜ 
회원작성글 AD석사생  |  05.16
Q. cell cycle gating
안녕하세요. cell cycle gating 관련 문의드립니다.   aneuploidy를  PI staining을 통해 분석하고자 하는데 어떻게 gating 을 하는것이 맞는지 모르겠어서 질문 드립니다. 보통 cell cycle 분석시 gating을 Gate3부분만 잡아서 histrogram으로 보고 있는데요.  주로 cancer cell에서 gate4 부분이 많이 생긴다고 하는데 그 이유가 궁금해요... 혹시 이부분을 aneuploidy로 볼 수 있는 건가요?? chromosomal instability에 의해서 gate4 부분이 증가 할 수있나요?   아시는 선생님들 답변 부탁드립니다ㅠㅠ 
회원작성글 truth  |  05.16
Q. exosome lysis for WB
exosome을 lysis 해서 protein을 확인하려는데 protocol을 보니 그저 2x sample buffer를 이용하라고 되어있더라구요 혹시 저희 lab에 5x sample buffer가 있는데 DW로 dilution해서 2x sample buffer로 사용할 수 있나요? 그리고 protocol에서 loading buffer를 사용하라는 내용도 있는데 Running buffer를 사용해도 될까요?
회원작성글 별헤는밥  |  05.16
Q. DNA extract kit로 RNA를 뽑을때는멸균환경에서 해야하나요??
DNA 뽑을때 멸균해야하는지 질문을 올렸더니 너무 감사하게 아래처럼 답변을 해주셨습니다!   일반적인 실험테이블에서 하면 됩니다 막 cleanbench안에서 하고 그 정도는 안해도 됩니다 당연히 실험하실때 실험대 닦기도하고 시약들은 auto된거 사용하는 정도는 하시니까 그대로 진행하시면 됩니다 조금다르게 RNA 뽑을때는 신경 많이 쓰셔야됩니다   그런데 토양 16S RNA 분석을 진행할거라 RNA를 뽑는건데 신경을 많이 써야한다는게 RNA 를 뽑을 때는 꼭 클린벤치에서 진행해야한다는 말씀이신걸까요?? 항상 많은 도움 주셔서 너무 감사합니다.
회원작성글 Seoki  |  05.16
Q. uv 흡광도 대입 y값. 및 실험 결과 및 고착
uv 흡광도 대입해 y 값을 구하는 실험인데 해석을 못하겠네요 조금 도와 주시면 감사하겠습니다
회원작성글 바이오과학생  |  05.16
공지사항
2020년 실험 Q&A 우수 참여자 선정 안내.
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세오 연재중실전 실험 프로토콜 101
세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
박은총 연재마감후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
Mr.S 연재마감의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재마감실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
이제욱 연재마감생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
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