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Q. RNA-seq 관련해서 질문드립니다.
RNA-seq 관련해서 셋팅을 진행하고 있는 대학원생입니다. Kallisto와 STAR를 이용해서 진행하고 있습니다.   1. Alignment tool별로 데이터가 유효한지 확인하기 위해서, Alignment tool 중에서 Kallisto와 STAR 를 둘 다 비교했는데요, FDR < 0.05 값들 중에서 많은 수의 DEG가 어느정도 유효함을 확인했습니다. 하지만 alignment 를 무얼로 했느냐에 따라서 FDR < 0.05 gene 들을 비교해볼 때, 대부분의 유전자에 대해서 LFC = -1.4 다른 한쪽은 -1.2 이런식의 섬세한 값차이가 있고, 몇몇 소수의 gene들은 LFC = -5.6, Fold change = -1.4 이런 큰 차이가 있습니다. STAR alignment시에 option이 너무 많아서 STAR를 잘못쓰는게 아닌지 하는 의심도 드는데요, 물론 method가 다르기 때문에, 다르게 나올 수 밖에 없다고 생각하는데, 이러한 섬세한 값 차이, 혹은 몇몇 소수의 큰 Variation 차이는 넘어가도 괜찮은지요? 당연히 발생하는 일인지요?     2. 일부 유전자에 대해서는 검증용 qPCR 을 진행했는데요, 저희 연구실에서 reference gene을 여러개 사용하는데, 검증용으로 qPCR 데이터를 보여줄때, RNA-seq상에서 유의미하게 FC 차이가 안나는 reference gene을 고의로 선정해서 검증해도 괜찮은지 궁금합니다. reference gene들을 RNA-seq상에서 확인해봤을 때, control vs experiment 에 따라서 RNA-seq 상에서 -0.6~06 log2FC 가 왔다갔다하는데, 만약 qPCR로 검증한 데이터를 publish한다면, 어떤 유전자로 정량한 값을 보여줘야하는지요?   고견 주시면 감사드리겠습니다.   감사합니다.    
회원작성글 신입입니다  |  09.28
Q. RNA quality check (nanodrop/gel electrophoresis) trouble shooting
안녕하세요.   RNA 추출 정제 퀄리티 분석에 질문이 있어 브릭 선배님들께 질문드립니다.    저는 미세조류를 연구중인 박사과정생입니다.  RNA 추출 및 qRT-PCR 분석을 주로 해오다, RNA-seq 분석을 위해 준비중입니다.  세포를 대량 배양한 뒤 stress를 제공하고 전체 전사체 변화를 관찰하는 것을 목적으로 하고 있습니다.  문제는 새로운 균주를 분리하였는데, 그 균주(규조류)의 mRNA purity에 문제가 있는 것으로 보입니다.  먼저 고농도의 mRNA을 얻고자 Trizol method를 이용하여 추출 후 전기영동하여 확인했습니다 (TBE, 100mV, 15min, 1% gel).   1번 2번 3번 모두 서로 다른 균주입니다(2번이 문제의 규조류입니다).   근데, 2번 샘플만 smear가 형성되며 밴드가 잘 확인되지 않습니다.  Sample ID Conc. Unit A260 A280 260/280 260/230 Factor 1 168.959 μg/ml 4.224 1.899 2.224 2.089 40.00 2 324.389 μg/ml 8.110 4.829 1.679 0.998 40.00 3 84.607 μg/ml 2.115 1.023 2.067 2.247 40.00 260/230 결과도 좋지 않게 확인됩니다. 농도는 좋은데, 농도가 왜 높게 나왔는지 원인 파악이 어렵습니다.    trizol reagent 존재 하에 cool-homogenization 이후, chloroform을 처리하였고, 12000g 에서 15분 원심분리하였습니다. 1,3번 샘플들과 달리 2번에서만 보이는 특징은... 유일하게 노란색 상층액이 형성되었습니다. 이를 isopropanol 처리 후 pallet을 형성하였을때 불투명한 베이지색 pallet이 형성되었습니다.  다행이 DW에는 잘 녹았지만, quality를 믿기 어려운 결과가 나와 재실험을 들어갔습니다.    농도를 포기하고 purity를 높이기 위해 membrane column형식의 gene all kit (RiboEX )를 이용하여 RNA를 추출하였습니다.  이때 탄수화물/당류의 오염을 고려하여 cell이 담긴 RiboEX 용액에 chloroform을 처리하는 것이 아니라, homogenization 이후 cell debris와 RiboEX 용액을 분리한 뒤 chloroform을 처리하였습니다. 이후 12000g에서 30분간 원심분리하여 최대한 깨끗한 상층을 얻고자 하였습니다. (원심분리 이후 상층액의 노란 정도는 줄었지만, 여전히 깨끗하진 않습니다)   Sample ID Conc. Unit A260 A280 260/280 260/230 Factor 22-09-28-2-diatom 33.820 μg/ml 0.846 0.417 2.028 1.256 40.00 22-09-28-3-diatom 53.770 μg/ml 1.344 0.667 2.014 2.009 40.00 22-09-29-4-diatom 77.667 μg/ml 1.942 1.061 1.829 1.417 40.00 규조류 시료를 세 가지 다른 방식으로 추출하였습니다(필터 제거, debris 제거, 필터 및 debris 제거 등).  그 결과 3번 샘플이 260/280; 260/230 모두 괜찮게 나와 기대를 갖고 전기영동을 내려보았습니다. (TBE, 100mV, 12min, 1% gel)  야속하게 18S, 28S 밴드가 보이지 않습니다. 또 특징중에 하나가, 이 규조류 샘플의 경우 trizol 및 RiboEX method 모두 가장 높은 peak가 260nm가 아닌 270nm에 가깝게 나타났습니다. 이러한 경우 오염에 의해 RNA-seq 분석이 어려운 상태인지 선배님들의 견해가 궁금합니다.  또, 규조류의 RNA 전기영동시 rRNA 밴드가 형태가 끈적한 물질에 의해 smear처럼 형성하는 것인지, 혹은 실제로 RNA가 다 분해된 것인지 의견을 여쭈어 보고 싶습니다.    브릭에서 올라온 해결 방안들을 보면서 여러가지 method를 실험해보았지만, 명확한 해결 방안을 찾지 못했습니다. 경험 많으신 선배님들의 많은 조언 부탁드립니다.    감사합니다. 
회원작성글 팡  |  09.28
Q. bacteria transformation 결과 확인을 위한 pcr이후 전기영동에 관한 질문
안녕하세요 학부 실험과제를 작성하다 궁금한 점이 생겨 질문 드립니다. bacteria transformation 결과 확인을 위해 pcr이후 전기영동을 했을때 positive control과 negative control을 사용하여 비교한다고 알고 있는데요. 이때 positive control에는 제작한 재조합 plasmid를 사용해 이것과 일치하는 지를 비교하는 것이고 negative control은 잘못된 예시로 판별한다고 하는데 이때 궁금한 것이 그냥 positive control만 사용해도 transformation이 잘 되었는지 알 수 있는 것 아닌가요? 왜 negative control를 사용해야하는지 잘 이해가 안갑니다. 또한 왜 negative control를 거의 증류수로 사용하는지 궁금합니다.
회원작성글 리코타치즈샐러드  |  09.28
Q. [H&E] Rat Kidney, Rabbit Liver H&E Staining 질문드립니다.
안녕하세요? 저는 광메카 전공중인 대학원생입니다. microscopy system develop을 위한 H&E slide를 직접 만들어야 해서 일반에 공개되어 있는 H&E protocol을 따라 slide를 제작하였습니다. 그래서 생물학적 지식이 전무한 상태인데요ㅠㅠ H&E Staining 후 결과를 보고 의문의 생겨 질문 드립니다.   sectioning 과정 중 갈라짐이 있었지만 무시하고 염색을 진행하였습니다. Rabbit Liver staining 후 관찰해 보니 Eosin이 염색된 부분 중간 중간 동그란 점..?같은 것이 보이고 있습니다. 특이사항으로는 Rabbit의 경우 fixation이 약 20개월 정도 된 오래된 sample입니다. 혹시 PFA 찌꺼기가 남아서 저렇게 보이는걸까요??...   위 사진은 Rat Kidney로, Diabetes model입니다. Rat은 8월 6일 고정한 비교적 싱싱한(?) sample 이용하였습니다.   Eosin staining 후 washing은 water dipping으로 3회 *2번 실시하였습니다. washing이 불균일해서 Eosin이 찌꺼기처럼 남은것인지, Eosin이 sample의 특정 부분을 염색한 것인지 저 "빨간 점"이 의미하는 바가 무엇인지 도움 요청드립니다.  
회원작성글 dhddl330  |  09.28
Q. 혐기성 세균 injection 실험
혐기균 다뤄보신 분들께 질문이 있습니다. 혐기균을 마우스에 treat할 때 어떤 방법을 사용하시는지 궁금합니다. 죽어있는 균 말고 살아있는 균을 마우스에 injection 시키고 싶은데, 방법이 따로 있는지 여쭤봅니다!
회원작성글 kkykk  |  09.28
Q. GC-FID 분석 중 Peak 사라짐 첨부파일
안녕하세요 GC-FID 로 보존제 분석하고 있습니다. 첨부파일은 calibration level 1~5 입니다. level 4 번 결과에서 주피크가 없으며 다른 피크가 나왔습니다. 원인이 무엇일까요? 표준액을 잘못만든 것은 아닙니다. 동일 바이알로 다시 inject 했을때 주피크가 나왔습니다. 분석을 할때마다 level 4번과 같은 상황이 무작위로 불특정하게 발생됩니다. Liner, septum, syringe 를 교체를 해도 발생됩니다. 원인이 너무 궁금합니다
회원작성글 혜야23  |  09.28
Q. 스탠다드 커브 없이 LC 정량분석 하는 방법 질문이요
스탠다드 커브없이 표준물질의 Area 넓이에 대입하여 샘플 정량분석하는 방법이 있다고 하는데 주어진 정보로 식 알려주세요ㅠ 표준물질 농도 10mg/10mL를 5배 희석 후 LC 분석결과, 표준물질 단일 peak Area 2453.6 샘플의 농도 100mg/10mL 희석 없이 LC 분석결과, 표준물질과 같은 시간 peak Area 230.8
회원작성글 초심자의행운  |  09.28
Q. 미지 미생물 동정 (dna sequencing 의뢰)에 앞서..
미지의 미생물을 채취하여 배양한 뒤 시퀀싱을 의뢰해서 동정하는 실험을 진행하고 싶습니다. 의뢰하려는 기업은 cosmogentech을 생각하고 있습니다.   제가 미생물을 채취한 뒤 순수분리 해서 의뢰를 드리면 시퀀스 분석을 해주시는 건가요? 분석을 맡기기에 앞서 제가 실험실에서 해야 하는 작업이 어떤 것들이 있는지 궁금합니다. PCR을 진행해야 하나요? 비용은 어느정도 되는지 궁금합니다. 감사합니다 ㅠㅠ
회원작성글 신민성의용암수  |  09.28
Q. NK cell의 IFN-gamma 농도 측정 결과 질문입니다
안녕하세요 저는 운동 전,후의 NK cell의 IFN-gamma를 측정하는 실험을   했는데 Kit은 NKmax의 NK vue kit을 사용했습니다.   궁금한 것이  36명을 대상으로 측정했고 standard range가 0~2000pg인데 대상자의 절반이 이상이 2000pg가 넘게 나오더라구요 standard에는 문제가 없어 보이고 saturation 된 것 같다고 하는데 saturation 된 데이터는 사용 할 수 없는 건가요? 재실험을 할 수 없는 상황이라 데이터를 사용 할 수 있는 방법은 없는걸까요?  
회원작성글 NKCA  |  09.28
Q. C사의 DNA 염색 시약에 대해... 첨부파일
먼저 제조사는 명기하지 않고 C사라 하겠습니다. 제가 사용한 것은 10,000x ETBR 대응 blue light 발광 시약입니다. 퀄리티는 매우 좋게 나왔습니다. dye와 ladder를 섞어 놓고 볼륨의 양으로 loading 한 결과 사이즈 차이가 나는 것으로 확인했습니다. 여기서 일반적으로 생각할수 있는건 dye의 분자량이 영향을 줘서, 많은 양의 ladder를 loading 하면 속도가 느리고, 적은양의 ladder는 상대적으로 빠르게 이동한다라고 보는게 일반적일 것입니다. 이 데이터를 가지고 본사에 문의한결과 Dear Customer, thank you for your request. Commonly low amount of DNA showed fast run and high amount of DNA showed slow run, the same behavior is showed by the proteins. The run depends from the amount of DNA sample loaded and not from the green stain used at the same quantity for each DNA samples. DNA의 양에 따라 이동속도가 차이나는 것은 당연하다 라고 답변을 주네요... 여러분은 어떤게 맞는 것 같습니까? 1. DNA 양이 많으면 dye가 더 많이 binding 하여 이동속도에 영향을 주었다. 2. 아니다 같은 비율로 dye가 바인딩 하니 DNA의 양에 따라 이동속도에 영향을 주었다. 참고로 제조사인 C사는 결코 작은 회사는 아닙니다. 형광쪽으로 유명한 회사입니다.
회원작성글 안재진  |  09.28
Q. EC50 실험 대행 업체 문의
안녕하세요 저희 랩에서 의약품 후보물질이 있는데 질병모델 마우스에서 효능 비교를 하려고 합니다. 동물 실험이 가능한 상태가 아니라서 업체에 맡겨야 하는데 관련 실험을 해주는 업체를 추천해주실 수 있나요? 지금 아는 곳은 오송첨단의료산업진흥재단 밖에 없습니다.
회원작성글 Eccentric  |  09.28
Q. HPLC로 당분석 중입니다.
안녕하세요 HPLC로 당분석 중인 대학원생입니다! 컬럼은 NH2컬럼 사용중이고, MP는 ACN이랑 DW랑 혼합하여 gradient를 걸면서  쓰고 있습니다.  그런데 Retention Time이 비슷한 두 피크가 농도가 높아지면서 분리가 잘 안되는데, 분리를 높일 수 있는 방법이 있을까요? 그리고 글을 보다보니까 당알코올은 다른컬럼을 써야한다는 글을 봤는데, 당알코올은 더 적합한 컬럼이 따로 있나요?
회원작성글 복어  |  09.28
Q. b-mercapto 가 protein cleavage 할수있나요?
b-mer은 polymer 의 s-s bonds를 끊는 것으로 알고있습니다.  제 WB실험중 단백질의 band의 size가 원하는 size보다좀더 낮게 나왔습니다.  (glycosylation을 고려해도 훨씬 낮게나왔습니다.)  단백질 4차구조에서 disulfide 를 끊어 monomer상태의 단백질을 b-mer가 더 cleavage해서 size가 낮게나온걸까요...? 처리 농도는 회사 protocol대로 처리하였습니다
회원작성글 오우  |  09.28
Q. human papillomavirus (hpv) 바이러스 효능 실험하는 대학이나 업체 있을가요?
회사측에서 HPV 를 가지고 항바이러스 효능실험을 의뢰 (용역의뢰)하고싶은데, 마땅히 할 곳을 국내에서 못찾겠네요. 대학이든 기업체든 상관 없으니 HPV나 HPV pseudovirus를 이용해서 항바이러스 효능 실험 진행이  가능할 곳 없을까요? 
회원작성글 ldk6407  |  09.28
Q. BIONEER BST solution 역할관련 질문드립니다.
안녕하세요? Purification 과정 중 사용하는 BST solution 관련 질문이 있어서 글을 올리게 되었습니다. BIONEER에서 PCR/GEL purification kit나 Mini-prep kit 같은 키트들에 보면 BST solution이 추가된것 같은데 이게 무슨 역할인지 궁금합니다. MSDS보면 EtOH랑 NaOH가 포함되어있고, sample을 column에 transfer하기 전에 미리 BST solution을 column에 뿌리고 센트리한 다음에 sample을 transfer합니다.  Mini-prep의 경우 Lysis buffer에 NaOH가 들어있어서 이것과 비슷한 역할 인가 했으나 Mini-prep말고 다른 여러가지 column을 사용하는 실험에는 다 BST solution 관련 언급이 되어 있어서 역할을 잘 모르겠습니다.. 알려주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 Hms  |  09.28
Q. DNA 질문입니다
실험 문의는 아니고 DNA 복구 기작에서 궁금한점이 있습니다. DNA 복구 기작중 뉴클레오티드 절제 복구, 광분해 복구, 염기 절제 복구가 있는 것으로 알고 있습니다. 인간의 경우는 광분해 복구는 안일어나는 것으로 압니다만 세균에서는 셋 다 일어나는 것으로 압니다. 세균에서 그리고 인간에서 어떤 경우에 각각의 복구 기작이 일어나는지 궁금합니다. 예를 들어 DNA에 존재하는 유라실의 제거 복구에는 염기 절제 복구가 일어 나는 것으로 알고 있는데, 이때 뉴클레오티드 절제 복구가 일어날 수는 없는지 말입니다 그리고 뉴클레오티드 복구 기작에서도 염기 절제 복구에서도 인산 다이에스터 결합을 끊는거로 아는데 이는 공통된 특징인지요    
회원작성글 rlawhddjs4..  |  09.27
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2020년 실험 Q&A 우수 참여자 선정 안내.
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세오 연재중실전 실험 프로토콜 101
세오 (필명) (Cincinnati Children’s Hospital Medical Center)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
박은총 연재마감후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
Mr.S 연재마감의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재마감실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
이제욱 연재마감생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
금주의 인기Q&A
실험데이터 이해가 안됩니다 제발 도와주세요...! [7]
Hela cell 에 이상한게 보여요.. [9]
RNA extraction [12]
b-mercapto 가 protein cleavage 할수있나요? [28]
e.coli의 transformation [2]
gram-staining을 했는데 양성인지 음성인지 잘 모르겠네요 [6]
cell culture에 HEPES가 꼭 필요한가요? [1]
Autophagy는 질병에 있어서 좋은건가요 나쁜건가요? [1]
액체질소통에 스탁보관 질문드립니다 [2]
PCR실험 시 dilution할 때, volume이 큰 것부터 넣는 이유... [1]
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