안녕하세요 바이오 고수님들께 궁금한 답을 찾고자 이렇게 글을 쓰게 되었습니다!   저희 실험실에서는 지금까지 CRISPR/Cas9 system을 이용해서 여러가지 Knock-out cell line 제작을 했었습니다. 이 때 plenti CRISPR cas9 ver2 벡터를 이용했고, 만든 벡터를 (sgRNA 넣어준 벡터)  Electroporation방법으로 세포 내에 벡터를 넣어주고 puromycin selection을 해서 K/O cell line을 제작을 하는 방법을 사용했습니다.  1. 궁금한 점은 electroporation 방법으로 세포 내로 pLenti CRISPR cas9 plasmin 1개만 넣어주었는데 이 벡터가 어떻게 chromosome 내로 insertion이 될 수 있는지? (plenti CRISPR cas9 plasmid vector 내에 PuroR sequnece가 있음. 5'LTR, 3'LTR 사이에 gene이 있다고 해도 Integrase가 있어야지 세포 내로 Integration이 될 수 있는 것이 아닌지? ) (LTR에 integrase binding 서열이 있는 것이지 integrase 가 있어야지만 integration 될 수 있는 것이 아닌지?)   2. 이러한 물음을 가지게 된 계기가 .. pCW57-GFP-2A-MCS 벡터 (All-in-one doxycycline inducible lentiviral vector for expression of one gene in combination with turbo GFP using the P2A self-cleaving peptide.) 를 이용해서 Target gene을 Inducible 하게 발현하는 세포를 만들고자 하였는데, 이 벡터1개를 세포 내에 Electroporation해서 넣어 주었는데 세포가 잘 만들어지지 않아서 논문들을 찾아보니 대부분 Virus infection 방법을 이용해서 (packaging vector와 같이 HEK293T에 먼저 transfection) 세포를 만드는 것을 확인 하 였습니다. K/O cell line을 만들 때 plenti CRISPR cas9 벡터 1개만 electroporation해도 cell line이 잘 만들어졌기 때문에 pCW57-GFP-2A-MCS 벡터도 동일하게 넣어준 것인데 혹시 문제점이 있는 것인지 궁금합니다..! 답변 주시면 정말 감사할 것 같습니다.. 대학원생 분들 모두 화이팅 입니다!  감사합니다.    

gel extraction 진행후 ratio까지 확인했습니다. ratio는 잘나왔지만 6ng/ul 나왔습니다.  너무 적은거 같아서요 cloning 실험 하는데 최소 몇 ng 까지 있어야 하는지 알려주시면 감사하겠습니다.!  

mutagenesis 실험 중인데, 결과가 이상하게 나와서 문의 드립니다. 예상데로라면 8Kb에 떠야하는데 NEB 방법데로 했을 때는 아예 끌리듯이 나왔고 Agilent 방법데로 했을 때는 non-specific 이 뜹니다.   어떤 분은 둘 다 모두 아예 PCR이 안된 것 같다고 하시고 어떤 분은 annel을 20분까지 늘려보라하시는데   뭐가 맞는지 몰라 올려봅니다.   target size는 8Kb입니다

colony 키워서 dna prep후 double digestion 1hr했습니다. 두개 엔자임중 1개가 working안한것일까요?1exp 2019년인데 사용 위에 두꺼운 밴드는 무엇일까요? 안잘린 것인지 pseudo colony인지요? 1kb size marker사용.

* 첨부파일을 올리려고하는데 1개만 가능하다는둥.. 업로드가 안되서 제가 그냥 글로 설명합니다;;. 답변해주신분들의 조언에 따라 cut 없이 gel 내려서 밴드확인했으며, 16일에 prep한 거 / 20일에 prep한 것 / 어제 colony 1개씩 따서 prep한 것 두개. 해서 총 네개로 테스트했습니다. 원래 사이즈는 5.5kb인데 5kb에 딱 걸친듯 살짝 밑 사이즈에 뜨는 것으로 봐서 super-coiled인가 싶어서 문제가 없다 생각을 했고 1ug으로 네가지 전부 다 NdeI 1ul, cutsmart buffer와 함께 먼저 2시간동안 잘랐습니다. 문제는 자르고 나니  오늘 prep한 애들은 ㅡ.ㅡ;;; 밴드가 사라졌습니다...;; 다만 16일과 20일에 prep한 애들은... 좀 smear하긴 하나 밴드가 linear 폼으로 잘려서 그런지 위와 다르게 5kb 살짝 위로 남아있어서 반응이 문제없이 된 것 같아서 현재 gel purification진행 중입니다. 도대체 때문에 이런 일이 발생하는걸까요 ㅡ.ㅡ;;  갑자기 저렇게 흔적도 없이 잘리려면 plasmid가 뭔가 문제가 있던가... 뭐든지 지금 DNase에 contamination됬다는 건데 혹시나 싶어서 새팁, 새 DW까지 썼는데..오염은 아닐것 같습니다.. 

안녕하세요? 환자 DNA의 변이를 haplotype에서 확인하고자, cloning 후 sequencing해서 보려고 합니다.   환자 혈액에서 분리한 RNA를 가지고, cDNA를 만들고, 그다음 gel extraction->cloning->sequencing 단계를 계획하고 있는데요.   환자전혈이 500ul 정도 될까말까하다보니  샘플을 다 써버릴까 걱정이 되어서 RNA를 아끼기위해 cDNA 를 사용하여 PCR를 한 다음 PCR product로 second PCR를 고민하고 있습니다. 제 실험 목표에 적용하여도 되는 실험방식일지 많은 의견 부탁드립니다.   지금 진행단계는 cDNA까지 합성하여서 sequecing으로 서열확인까지 하였습니다. 100ng cDNA로 PCR하고, gel에 2ul loading해보면 ACTB는 어~엄청 빵빵한데 cloning할 유전자는 밴드가 희미해서 second PCR을 고민하게 되었습니다.      

 LB Broth에 ampiciline넣은 액체배지 빛차단해서 냉장보관시 유효기간이 얼마나 될까요? 2022.10월에 보관한것인데 ecoli키워도 될까요?

 pCambia1391Z vector 를 구합니다. 해외 주문해도 너무 오래걸려서요. 혹시 있으신 분은 imspirits@daum.net 보내주세요. 제가 찾는 게 맞다면 제가 소정의 보답 드릴게요.  

cloning하는중에 clone size확인하려고 agarose gel에 샘플 loading후 voltage는 어느정도로 하는지요? 빨리 달리기 위해 200V는 너무 빠른가요? 사이즈에 따라 적정 전압이 있는지 궁급합니다 감사합니다.

Bac-to-Bac에 대해 가볍게만 들어본 상태인데 실험을 하는 도중 좀 더 내용을 이해하고 싶어서요,,, 이해도 안 된 상태에서 바로 실험을 시작한 것 같네요 전반적인 Bac-to-Bac도 궁금하고 cloning과정 후 왜 Bacmid라는 과정이 필요하고 그것이 정확히 뭔지가 가장 궁금합니다,, 구굴에는 너무 방대한 내용들도 많고, 전체적인 Bac-to-Bac과정이 머릿 속으로 잘 그려지지가 않아요,,   도와주세요!

안녕하세요  Bacmid하는 중인데 DH10Bac Transformation후 midi-prep과정에서 궁금한 게 생겨서요 mini, midi, maxi-prep으로 나뉘던데 이것들은 그냥 키우는 스케일에 따라 구별되는 것인지 아니면 DNA사이즈에도 영향을 받는 것인지 궁금합니다. (작은 사이즈이면 mini프랩을 하고 뭐 그런 의미도 포함되어 있나요?)   ..잘 몰라서 죄송합니다

Cloning을 해야할 일이 있어서 사용할 Backbone vector를 쓰려고하는데 정량으로 양을 확인하려고 하니까 정량 할수록 자꾸 점점 양이 줄어드는 기이한 현상이 생겨서 갖다버리고 (예전에도 기억에 얼핏 문제가 있었던 것으로 기억)... 새로 stock에서 prep해서 뽑았는데 정량은 되는데 1ug정도의 plasmid를 enzyme으로 cut을 하면 이게 밴드가 없습니다. 아무리 하루 overnight해서 전부 다 잘라버리는 현상이 있는가 싶어도 여러 밴드도 아니고 아얘 아무것도 안보이는 건 말도 안된다싶어서 남은 vector를 시퀀싱을 맡겼는데 primer가 binding되지않는다며 시퀀싱에 실패(....) 그럼 그 이전에 만든 stock으로 다시 prep을 해봤지만 역시나 정량은 되는데 밴드가 안보이는걸 봐선 해당 plasmid stock이 옜날부터 맛탱이가 간 것 같습니다. (옛날에 계신 선배나 박사님이 만든걸로 추정됨) 밴드도 안뜨는데 그럼 도대체 뭐가 정량이 되는걸까요?;; Genomic DNA는 prep 과정에서 침전되는걸로 알고있는데..... 집어넣을 DNA PCR까지 잘 끝났는데 해당과정에서 문제가 생겨서 진행을 못하고 있습니다.

cloning하는 중에 콜로니 dna prep후 enzyme double digestion해서  gel run했는데 위에 밴드는 무엇일까요? uncut? 2개 엔자임중에 한개가 아무래도 유효기간이 오래 된 것이라 working안한건지 .....아래밴드는 5kb정도에서 보이긴 하는데 이 gel 사진만으로 콜로니들이  pseudo colony라고 판단할 수 있나요?

클로닝 하기위해 벡터를 double digestion 한뒤 CIP처리하면 벡터만 self ligation된 콜로니가 절대 뜰수가 없나요? 콜로니가 7개만 떴고 DNA 프랩후 잘라보니 insert size0.7kb는안보이고 벡터인지 뮌지 알수없는 사이즈가 보여서요.모두 Pseudo인까요?

안녕하세요. 다름이 아니라 대학 실험 과제 중 궁금한 부분이 생겨 질문드립니다. gene cloning의 과정 중에서 vector를 추출하고 난 후 insert와 ligation을 하고 transformation하는 과정을 진행 중인데요. 이때 ligation 과정에서 insert 대신 elution buffer를 넣어 control group으로 사용을 하는데 이때 왜 하필 elution buffer를 사용하는지 그 이유를 아시는 분이 있으실까요? 제가 검색을 못하는 것인지 이 것에 대해서는 검색해도 나오지가 않습니다 ㅜㅜ ligation을 할 때 mixture의 조성이 vector, insert(elution buffer), 5X buffer, ligase입니다.

안녕하세요. cloning 진행하기 위해서 바이오닉스에서 plasmid DNA 를 주문하였습니다. 그런데 4 ug 의 양이 lyophilized DNA 형태로 왔는데 여기에 DW 로 dilution 시켜서 사용하면 되는 것이 맞나요? 이게 맞다면 DW 는 얼마나 넣어야 하는 건가요?