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Q. blunt end ligation
blunt end ligation하다가 잘 안되는 부분이 있어 질문 올립니다. Vector는 2.7kb, 6kb로 Sma1 처리를 하여 blunt end, Insert는 1.2kb (Pfu polymerase, PCR product)로 둘다 blunt end 입니다. 농도랑 순도 모두 100ng/ul 이상, 2.0 (260/280)이며 ligation 시 10:1 (Insert/Vector), 4℃, O/N로 진행하고 있습니다. 근데 계속 Vector selt ligation만 나와 고민 중입니다. (제한효소, Insert primer로 확인) 저가 생각한 대안은 아래와 같습니다. 1) Insert/Vector 비율 늘리기 2) ligation 시 Sma1 소량 넣어 진행 (buffer, Sma1 volume 등 정확한 protocol은 모름) 혹 이것 외에 더 효율적인 방법이나 놓친 부분이 있을까요?    
회원작성글 구릅  |  12.01
Q. SDM 안되는 polymerase도 있나요?
이전에 SDM(Site-directed mutagenesis) 관련하여 질문을 올렸었습니다. (https://www.ibric.org//myboard/read.php?Board=exp_qna&id=789382)   골자는 SDM이 되지 않는 것에 대해서 조언을 구하는 글이었는데.. 결국 성공하긴 했습니다만, 여전히 매우 낮은 효율때문에 다시 질문을 올리게 되었습니다.   현 상황을 요약하면 다음과 같습니다.     vector 전체 size는 3.5kb로 작은 편이고,   primer design은 다음과 같이 C ▶ T로 바꾸는 것을 목표로 하여, 33mer 로 design 하였습니다.   snapgene 상에서의 Tm값은 63도로 계산되나, 사실 primer 자체는 Agilent quickchange webdesign tool로 design 한 것이며, Agilent quickchange protocol은 annealing Tm 값을 55도 기준으로 맞춰준다고 합니다.     PCR mixture : total volume 50ul (high fidelity Pfu)에 template vector 500ng (기존 200ng)   PCR cycle :  95°C 30s 95°C 30s 55°C 60s 68°C 4:30s (기존 kb/30s 에서 kb/1min로 수정) step 2부터 X 18  68°C 13:00   PCR이 완료되면, 바로 PCR product에 DpnI 1ul 넣고 37°C 에서 6h incubation    그리고 com-cell에 heatshock 주고, 1ml plain LB에서 120min (기존 40min) 돟안 shaking incubation   마지막으로 1ml LB culture medium centrifugation 하여, 가라앉은 com-cell pellet과 soup조금만 남기고, 적당히 pipeting하여 suspened하게 만들고 Amp(marker입니다.) plate에 spreading       빨간색으로 표기한 부분이 저번 질문에서 올린 protocol과 다르게 한 부분입니다.   이렇게 수행하였더니 colony 3개를 얻을 수 있었습니다.. 물론 sanger 돌려보니 SDM 확인은 잘 됐는데요,   고작 3.5kb로 매우 작은 vector에서, 그것도 base 하나 바꾸는데 이렇게 효율이 안나오는 것도 이상하고, 이런 상태라면 더 큰 vector에서 a.a를 바꾸는 경우에는 아예 colony가 안뜰 것 같다는 걱정이 됩니다.   그래서 지금 문제를 찾고 있는데..       우선 총 2종류의 pfu기반의 high fidelity polymerase로 test를 진행하였습니다.   조건은 template 200ng template 500ng template 500ng+DMSO 로 잡고 진행하였습니다.   PCR 직후의 gel 사진을 보시면 (이때는 깜빡하고 control로 template을 걸지 못했습니다.. ㅠ) TOYOBO의 polymerase의 band intensity가 훨씬 높습니다.   사실 TOYOBO가 thermo보다 activity가 훨씬 높다는 건 기존에 잘 알고 있어서 해당 결과는 충분히 납득할 수 있었습니다.             Dpn1 4hr 처리 이후의 gel 사진입니다.   여전히 TOYOBO의 band intensity가 훨씬 높습니다. 해당 결과만 보면 무조건 TOYOBO에서 colony가 잘 떠야하는데..   결과는 thermo : template 500ng (w/o DMSO) 조건 딱 하나에서만 3개의 colony를 얻을 수 있었습니다.     저는 이 결과가 도저히 이해가 가질 않네요.   분명히 Dpn1 처리 이후, transformation 직전에 gel 사진에서는 TOYOBO의 band intensity가 훨씬 높은데, 정작 되는건 thermo에서, 그것도 매우매우 낮은 효율로 되는게 이상합니다.   본문에서 진행한 실험 말고도, 여태까지 try를 모두 TOYOBO로 했었는데 전부 안되는 것으로 보아 현재까지는 SMD을 수행하는데 있어 TOYOBO polymerase가 부적합 하다고 밖에는 생각되지 않습니다.   그래서 TOYOBO maual을 잘 찾아보니까..         해당 pol에는 3' exonuclease activity가 있다고, enzyme cut 하기 전에 purify하라고 나와있는데, 이것 때문일까요..?   근데 3' exo activity는 pfu 기반이면 다 있을 수 밖에 없는 건데, (klenow fragment가 아닌 이상에야) 왜 TOYOBO만 그런걸까요..         관련하여 선생님들의 조언과 의견을 여쭤보고 싶습니다.   감사합니다.
회원작성글 neuronal p..  |  11.29
Q. 동물세포DNA를 e.coli로 cloning하기
말그대로 동물세포의 DNA를 E.coli로 transformation? transcription? 싶은데 intron을 어떻게 제거해야하나요?   RNA 중합효소와 역전사 효소를 동시에 넣고 반응시킨 후 gel puri하면 exon만 있는 DNA를 얻을 수 있을까요?
회원작성글 SHY  |  11.18
Q. 80%glycerol 보관기간
stock 만들 때 80%glycerol을 사용하는데요, 3월달에 만든걸 써도 괜찮은지 궁금합니다. 상온에 계속 보관했습니다.
회원작성글 김세은1  |  11.17
Q. transformation spreading 후 incubation에 넣기 전에
Cloning 중에 Transformation 까지 다 하고 plate에 spreading 까지 다 하고 나서 incubation overnight 시키기 전에 상온에서 30분정도 있었는데 괜찮을까요???
회원작성글 쪼꼬만먼지  |  11.08
Q. vector size가 왜 다르게 표시되죠?
https://www.abmgood.com/NDUFB7-Lentivirus-3165206.html#316520610296 위의 사이트에서 나오는 vector의 size를 보면 7681bp로 명시되어 있는데요, sequence를 보면 9336bp라고 나와 있어서 이해가 되지 않습니다. 벡터를 찾아보는 일이 처음이라 왜 이런지 알려주시면 감사하겠습니다...
회원작성글 Delos Aste..  |  11.05
Q. competent cell 만드는 과정 질문있습니다
클로닝에 쓸 competent cell을 직접 만들어 쓰려고 하는 아무개입니다. 실험 계획은 얼추 세웠는데 궁금한 점이 있어 질문드립니다. 1. 프로토콜을 읽어보니 마지막 단계에 cell을 aliquot 하고 액체질소를 부어서 급속냉동한다고 하는데 랩실의 어떤 분들은 이 단계를 건너뛰시고 바로 냉동고에 넣으시더라고요(물론 다른 프로토콜로 하시는 걸 수도 있겠지요). 급속냉동하고 안하고 효율에 유의미한 차이가 없나요?  2. transformation efficiency test 할 때 아무 벡터나 써도 상관 없을까요? 보통 puc19를 가지고 테스트 한다고 알고 있는데 가지고 있는 벡터의 크기가 puc19보다 많이 크다보니 잘 안될까 걱정됩니다. 3. efficiency가 어느 정도면 좋다고 판단하시나요? 시판되는 제품들 찾아보니까 회사마다 달라서 10^6부터 시작해서 10^9까지 올라가는데 뭐 쓰는 사람이 괜찮네 싶으면 땡인건지?  
회원작성글 란란루  |  11.01
Q. Cloning insert sequence에 의해서 plasmid prep 수율이 변할 수 있나요??
 추워지는 날씨에도 연구하시느라 고생이 많으십니다.  제가 최근에 parvovirus의 유전자를 cloning하고 있습니다.  Elpis사의 TOPO cloning kit를 사용하고 있는데요 (pLPS vector) & promega pGEM-T-easy vector 둘다 시도 하고 있습니다.  cloning 하고 transformation한 후에  colony PCR (primer는 insert 유전자 증폭한 것과 동일한 primer를 사용했습니다.) 하여 screening한 후에 picking하여 plasmid prep을 하면 이상하게 수율이 너무 안나오네요...  동시에 진행한 다른 plasmid sample은 수율이 잘나오는데 말이죠.. pellet의 크기가 작지도 않았습니다.. vector에 cloning한 유전자에 의해서 plasmid의 수율이 달라질수가 있나요??..  긴 글 읽어주셔서 감사합니다. 도움 주시면 감사하겠습니다
회원작성글 Anchovy  |  10.26
Q. Cloning 과정 질문
Cloning 과정질문입니다. 1. transformation heat shock 할 때 Heat block 42도 에서만 해야하나요? Water bath는 물들어가서 오염위험 힛쇽에는 쓰지말래요. 2.heat shock후 ice 2분두고 LB 1ml넣어 37c waterbath에 1시간 두래요. Shaking incubater에 두면 컴셀 약해서 깨질위험있데요. 3.plate에 ecoli 도말할때 알콜램프에 소독한 삼각밀대 쓰면 셀 컨탐, 약한 셀 깨진다고 비드로만 굴려서 하래요. 4.DH5a 에 플라스미드 넣고 파이펫믹스하지말고 그냥 플라스미드 흘려넣으래요. 약한 컴셀 깨진다고. 1ul dna를 컴셀 100ul속에 흘려넣으면 잘 섞이긴 할까요?파이펫 믹스는 안되나요? 5.플레이트에 콜로니 뜨면 키워서 DNA프랩후 엔자임 잘라서 insert있는지 확인하잖아요.엔자임 비싸다고 ecoli 상태에서 바로 gel run해서 사이즈 맞는것만 프랩하래요 Ecoli상태에서 젤런하면 Insert가 있는지 확인 가능할까요? 이 방법 사용해보셨는지요? 답답해서 미칠지경입니다. 답변 부탁드립니다. 감사합니다. Android용 Outlook 다운로드
회원작성글 BBlue  |  10.21
Q. cloning 시 primer frame
안녕하세요. cloning을 위하여 primer를 제작하는 와중에 궁금증이 생겨 질문드립니다. vector는 pET-32a를 사용할 예정이고, 제한효소는 EcoRq과 Hind III를 이용할 예정입니다. vector map은 저렇고, 제가 cloning할 부분은 CDS 부분이 아니여서 primer 제작 시 제한효소 sequence와 start codon을 넣고 하려고 하는데, 이 때 frame 맞추는 거에 대한 질문이 있습니다. 단백질 발현을 위해 frame을 맞춰야 하는데, 염기서열을 보면 3개씩 아미노산으로 translation이 되니 primer 제작 시 이것도 함께 맞춰야 하는거죠? 예를 들어, cag aat tcc ~이런식으로 되어 있을 때, primer 프로그램을 돌리면 5'-3'로 갈 때, ag aat tcc로 되는데, 괜찮은건가요? EcoR1 GAATTC+ start codon ATG + ag aat tcc 이런식으로 제작하는 게 맞는건지 primer 주문 전에 여쭤봅니다.  미리 감사합니다^^
회원작성글 꼭  |  10.17
Q. 클로닝할떄 플라스미드에 들어간 절편이 역방향으로 들어갔는지, 순방향으로 들어갔는지 구분법?ㅠ
클로닝할때 플라스미드에 BamH1을 이용하여 원하는 DNA절편을 삽입했을때 DNA절편이 순방향으로 들어갔는지, 역방향으로 들어가는지는  제한효소로 잘라봤을떄 단편의 크기에 따라서 알수있다고 하는데 이게 무슨말인지 이해가 안가네요,,,,, 제가 궁금한거는 1) DNA서열이 어차피 상보적인데 역방향으로 삽입되었는지, 순방향으로 삽입되었는지가 왜중요한지?? 어차피 복제되면 똑같은거 아닌가요? 2) 그래도 구분을 해야한다면 제한효소로 잘라서 크기에 따라서 알수있다는데 만약 BamH1을 이용해 자른다고 하더라도 2가닥 모두 잘리는거니까 역방향인지 순방향인지 구분을 못할거같은데,,, ㅠㅠㅠ 제가 이해를 잘못하고 있는걸까요?  
회원작성글 갈색솜뭉치  |  10.10
Q. cas9 primer관련 질문
Cas9 promoter가 어떤게 쓰이는지, gRNA gfp를 넣어주는 이유를 알수있을까요? 또한 primer를 제작할때 homologous arm을 넣어주는 이유도 알수있을까요?
회원작성글 학헉학도생  |  10.09
Q. restriction enzyme처리 후 DNA 전기영동 관련해서..
안녕하세요 학부생인데 실험하면서 결과 추론이 안되는 부분이 몇 가지 있어서 질문 드립니다.   1. 각각 형태가 다른 plasmid DNA를 전기영동하면 supercoiled form > linear form > nick (or circular ) form 순으로 band가 찍히는 걸로 알고 있습니다 만약 plasmid DNA의 크기가 1kbp라고 가정한다면, 전기영동을 하였을 때 linear DNA는 1kbp부근에서 band가 찍히고, nicked DNA는 1kbp보다 좀 더 큰 위치에서 band가 찍히는 것인가요?   2. insert DNA를 만드려고 DNA에 restriction enzyme처리 후 prep과정 거치고 전기영동을 해봤는데요 이상하게 몇몇 밴드는 다른 밴드보다 두껍게 나오네요  nanodrop 측정했을 때는 농도도 거의 비슷하고 모두 같은 양을 loading하였는데 무슨 문제일까요??.. 전기영동 전에 실험하면서 오염된 유기용매에 의해 band 모양이 달라질 수 있나요?
회원작성글 형준팍  |  10.08
Q. enzyme cutting과 관련하여 문의드립니다.
안녕하세요. enzyme cutting 과정 중 궁금한 내용이 있어 질문드립니다. miniprep을 진행하여 얻어낸 DNA를 microplate reader를 사용하여 측정하였습니다. 1. microplate reader를 사용하여 측정하였을 경우 단위가 어떻게 되나요? 2. 740정도의 결과값이 나온 것을 2ul를 분주하려고 하는데 2ul를 넣었을 때 1kbp이상의 값이 된다고 하는데 왜 그렇게 되는지도 궁금합니다. (1ul 측정)  
회원작성글 HuiJ  |  10.06
Q. 2개의 PCR product를 ligation시키는 과정에서 enzyme site가 이상합니다.
안녕하세요 cloning 실험을 진행중인 학생입니다. 현재 2개의 insert를 PCR을 통해 합성하여 ligation 시킨 후 vector에 넣어주기 위해 실험을 진행하고있습니다. 1번 PCR product  (SacI) GAGCTC-----------         -----------CGATCG (NheI)   2번 PCR product (NheI) GCTAGC------------          -----------CCCGGG (ApaI)   pirmer는 enzyme cutting이 잘 되도록 앞쪽에 AAA를 추가하여 제작하였고 PCR 후 enzyme cutting을 진행했습니다. (1H, 37 'C) 각각 enzyme cutting된 product는 gel에 loading하여 kit를 통해 extration하였고 takara ligation mix로 ligation을 진행했습니다. (1 H, 16 'C) 만들어진 ligation mix와 1번의 F primer, 2번의 R primer를 이용하여 PCR product를 제작하였고 size를 통해 ligation이 잘 되었는지 확인하였습니다.  이후 1번과 2번이 ligation된 PCR product를 enzyme cutting, gel extration하여 준비했습니다. 준비한 insert는 SacI과 ApaI으로 cutting된 vector에 1:3, 1:5 비율로 ligation 시켰습니다. transformation 후 colony PCR로 insert를 확인하고 mini prep하여 5개의 샘플을 sequencing 하였습니다.   sequencing 결과를 확인해 보니 GCTAGC로 있어야 할 NheI 부분이 5개 모두 GCTAGCTAGC  CGATCGATCG 형태로 나오고 있습니다.   원인을 찾아보려고 노력하는 중인데 해결이 쉽지 않아 질문 드립니다. 이러한 문제가 생기는 원인이 뭘까요?  어떤 자료들을 찾아봐야 원인을 알수있을지 너무 막막한 상태입니다. 도움이 될만한 키워드라도 생각이 나신다면 알려주시면 감사하겠습니다.    
회원작성글 무농약감자  |  10.05
Q. Gel extraction loading 농도
cloning 실험을 하고 힜는데, ligation 전에 insert, vector DNA를 gel extraction 할 때,  DNA 양을 얼마 정도에 얼마 정도 넣어 로딩을 하면, ligation 할 수 있는 양이 많아 질까요?    
회원작성글 dhehfl  |  10.02
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