cloning 할때 tRNA를 넣어준 vector map들을 몇개 보았는데요. 이론적인 tRNA의 뜻은 알겠는데 cloning에 tRNA를 넣어줬을때 무슨 역할을 해서 넣어주는지 알수있을까요?

제목대로 깜박잊고 그냥 미니프렙해버렸어요...lysis buffer넣기 전에 생각나가지고 resuspension buffer넣은 상태에서 glycerol 1:1로 넣고 stock만들면 안되나요?

안녕하세요.   miniprep 과정 중 궁금한 것이 있어 질문드립니다. 마지막 EA buffer 사용 시 DW로 대체하여 사용해도 된다고 하는데 왜 가능한지 궁금합니다. 또한, EA buffer 사용 시와 DW 사용 시에 차이가 있나요?  

안녕하세요 다름이 아니라 제한효소로 dna를 자를때 넣어야하는 buffer 양이 나온 표를 해석하기가 힘들어 질문 드립니다 ㅜㅜ 제가 쓰는 제한효소는 EcoRl와 BamHI라 두개가 만나는 점인 1xK만큼 buffer를 넣어야 한다는데 그래서 이게 총 얼마를 넣어야 한다는 것인지 궁금합니다. total 용액의 부피는 20ul입니다!!

안녕하세요 대학원 초년생입니다. 랩 구성원의 도움을 받기 힘들어서 질문글을 올리게 되었습니다.   Pichia ciferrii의 Translation elongation factor(TEF) promoter를 chormosomal DNA에서 PCR로 떠서 만들려고 합니다.   NCBI에서 TEF의 protein은 찾았는데, TEF gene에 대해서는 찾지 못해서 일단 protein sequence를 확인해왔습니다. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EF552563.1?from=1&to=867 해당 sequence의 앞쪽 seq을 알아야 promoter primer를 디자인 할 수 있을 것 같은데, 확인할 수 있는 방법이 있을까요?   추가적으로 하나만 더 질문 드리자면, Translation elongation factor와 elongation factor는 동일한 것인지 여쭙고 싶습니다.. Translation elongation factor and pichia ciferrii 로 검색을 했을 때 EF는 많이 나오는데 TEF는 검색되지 않아서요..  

일단 본격적인 질문에 앞서 본인 개초보 대학생임을 밝힙니다.... 질문 수준이 경악스러워도.....너그러이 양해 부탁...드립니다 Q1. 플라스미드 DNA에 제한효소 2개를 처리했습니다. 그 2개가 인식하는 부위가 각각 하나씩이라면 원형의 플라스미드 DNA가 두 덩어리로 쪼개지는 것이 맞는지...? 그리고 그 두 덩어리가 전기영동을 했을 때 길이가 긴 순서대로 위에서 아래로 band형태로 배치되는 것이 맞는지....? Q2. 제가 실험을 했을 때 이론상 길이가 짧은 밴드 길이가 원래 28bp가 나와야하는 것 같은데 실제로 실험을 해보니 480bp로 너무 원래 나와야할 것 같은 길이보다 크게 나왔습니다.플라스미드DNA와 제한효소, 완충액 등을 섞는 과정에서 상당히 많이 기포가 생겼었던 거 같은데, 이게 실제로 나와야 하는 band의 길이와 개수에 영향을 줄 수 있는지...? 기포 이외에 이러한 수치에 영향을 줄 수 있는 요인에는 어떤것이 있을지가 궁금합니다....   미리 답변 감사합니다...

클로닝 과정 중 insert DNA가 뒤집혀 들어가는 이유는 무엇이고, 이때 제한효소를 사용하면, insert DNA의 방향을 구분할 수 있다는데 그 방법이 무엇인가요?

안녕하세요 여즘 cloning을 배우고 있는 학부생입니다. vector map에 homologous arm이 다 달라서 이게 의미하는것이 무엇인지 궁금하여 질문드립니다. 또한 scaffold, promoter, terminator, start/종결 코돈을 넣어주는 의미도 알수있을까요?

안녕하세요. 클로닝 고수님들 지나가다 도와주시면 감사하겠습니다. 아래 1, 2번이 동일한 조건에서 동일한 vector에 다른 종류의 insert를 클로닝한 것인데요 ligation plate에서 self-ligation (40개 정도)과 비교해서 콜로니 개수가 1. 유사하게 형성 (40개 정도) 2. 2배 이상 형성 (100개 정도)   RE 처리해서 밴드 확인한 결과, 오히려 콜로니 개수가 적은 1번에서만 clone을 확인할 수 있었습니다. 많은 콜로니 개수가 많은 clone을 의미하는 것이 아닌지요? 제가 잘 몰라서..자세하게 알려주시면 감사합니다ㅜㅜ 2번 ligation plate에서 콜로니 picking을 다시할지, insert Back-transformation을 다시 해서 다시 클로닝할지..둘 다 해 볼지 모르겠어요

PCR 후에 제한효소 처리해주고  Gel 로딩하기 전에 제한효소 Inactivation 처리해주려고 80도씨 20min heat block 정치했습니다. 근데 제가 제한효소를 착각해서 Inactivation이 필요없는 sample도 같이 같은 온도,시간 조건에서 heat block 처리를 하고 gel에 로딩했는데 괜찮을까요? Band는 선명하게 잘 뜨기는 했습니다.

안녕하세요~! pET vector 사용해서 cloning 하려고 하는데 제한효소를 선택하는데 바로 옆에 붙어있는 제한효소 두개를 선택해서 사용해도 문제 없나요? vector map 보니까 BamH1이랑 EcoR1이 바로 붙어있더라고요,,

플라스미드 dna에 제한효소 처리 후 확인하는 실험을 했습니다 제한효소를 뜰 때 오차를 줄이기 위해 계면에서 떠야한다고 하는데 이게 무슨 뜻이고 원리가 뭔가요?

안녕하세요 이제 석사 4학기를 맞이하고 있는 석사생입니다. 부끄럽지만, cloning후에  sequencing을 하면 계속 vector form이 관찰됩니다...   PCR에서 원하는 target band size를 확인했고, 제한효소 처리 후 gel에서 관찰했을 때 제대로 잘린 것을 확인했습니다. colony도 제 경험에 근거했을 때 괜찮은 morphology로 적당히 떴는데, 5개를 sequencing 보냈더니 전부 다 vector form이 나오네요. Point mutation을 야기하기 위해 dna 서열 1개씩을 바꾸는 cloning이어서 primer에 해당 서열을 넣었는데, 이렇게 되면 해당 primer를 합성한 제조사에 문의를 드려봐야 할까요?? 제 실험 과정에서 vector form이 나올만한 또다른 원인이 있을까요?  혼란스럽네요ㅠㅠ  긴 글 읽어주셔서 감사합니다. 

안녕하세요? 항상 감사히 많은 도움 받아갑니다. 제가 알기로 eukaryotic promoter의 core-promoter에는 TATA박스가 있고, 거기서부터 약 26bp downstream 에 TSS가 있는데요, 정확히 어떤 base부터가 TSS인지 database로 제공되는 곳이 있는지요??   mouse IRF8 promoter의 TSS를 알고 싶습니다.. promoter sequence는 ucsc genome browser를 통해서 얻었고, core promoter region 안에 TATA box가 있는 것도 확인했습니다. 그런데 이 sequence 에서 정확하게 어떤 base부터가 tss인지,, 구글링을 해보아도 잘 모르겠습니다. 선배님들의 도움이 절실합니다ㅠㅠ 미리 감사드립니다!!

저는 고등학생입니다. E.coil 형질전환 실험을 하는데 플라스미드 dna를 사용해서 실험을 해야하는데, 플라스미드 dna를 따로 구매하거나 어떻게 해야지 추출 할 수 있나요?

안녕하세요. 석사1학기 입학전 실험실에서 준비중인 학생입니다. 제가 하려는 실험은 단백질을 클로닝을 통해서 발현시켜보려고 합니다. 교수님께서 실험디자인을 구상해보라고 하셔서 준비중인데 클로닝의 경우 Gateway Cloning을 해보라고 지정해주셔서 일단 cDNA 클론은 구매를 해서 기다리고 있고, 이후에 클론이 온다면 클로닝을 준비중인데 실험실에 혼자 석사생이다 보니 물어볼 사람이 없어 여기에 질문합니다.. 먼저 Topo cloning을 위해서 Entry 벡터를 만 든 후에 발현용 벡터로 옮긴후에 단백질 발현을 보려고 생각중입니다. t토포 클로닝을 위해서 앞의 CACC 서열을 넣어주려고 합니다.  그러기 위해서 primer를 짜야하는데 개시코돈 앞에 CACC서열을 어떻게 붙여줘야 할지 감이 잡히지 않아 고수분들께 여쭤봅니다.. 사소한 정보나 지적이라도 감사하겠습니다.. ( _ _ )

안녕하세요,, 지금 몇달째 TA cloning이 안돼서 고생하고 있는 대학원생입니다,, 1) cDNA를 template로 하여 Taq으로 PCR 합니다. 2) gel에 loading한 후 elution을 진행합니다. 3) RBC TA cloning kit로 ligation을 진행합니다. (PCR 기계로 22도 15분-protocol 그대로 진행) 이때, control 반응에서 T vector 2ul, control Insert DNA (10ng/ul) 3ul를 넣으라는 것을 보고 교수님께서 제 insert도 그대로 넣어보라고 하셔서 제 insert도 10ng/ul로 만들어 3ul씩 넣었습니다. 4) RBC competent cell (JM109)에 transformation 합니다. (com cell 100ul에 ligation 산물 10ul , 이후 protocol 그대로 진행) 5) white colony를 따 LB-amp에 키운 후 miniprep하여 plasmid를 뽑고 6) enzyme cutting 후 sequencing 합니다. 그런데 cutting후 loading한 사진을 보면 아예 잘리지 않았거나, 제 size로 잘린것 둘 다 나오는데 둘 다 sequencing을 보내도 vector만 뜹니다ㅜㅜ positive, negative 둘 다 잘 된걸 보면 ligation에 문제가 있는 것 같은데 두달동안 조건을 바꿔봐도 결과가 똑같네요ㅠㅠ   저번 한번은 너무 안돼서 교수님께서 실험 해 주셨는데 그 때는 결과가 잘 나왔습니다,, 그래서 교수님이 하신대로 똑같이 했는데도 왜 저는 안될까요,, 도와주세요ㅠㅠ  

gibson assembly 논문을 읽어도 명확히 이해가 되지 않아서 질문드립니다. 합치고 싶은 sequencing에 똑같은 sequencing을 달아서 합친다라고 이해하고 있는데 좀 더 정확히 설명해주실분 계실까요…

1번 Lane이 Restriction enzyme(BamHI, Hindiii)를 처리한 Vector(pQE80L, 4751bp)이며 2번이 Uncut vector입니다. restriction enzyme site가 고작 146~188 사이인데 잘랐다고 이렇게 크기 차이가 생길 수 있는지가 의문이 들어서 혹시 제가 잘못잘랐다면 계속해서 cloning을 진행하면 시간낭비일것같아서 혹시 경험상 이렇게 band의 size차이가 크게 나는 경우 제한효소 처리가 제대로 되었다고 볼 수 있을까요?

electroporation을 하기위해서 G+ lactococcus lactis competent cell을 제조하고있는데요.  제가 찾은 프로토콜에서 '0.5M sucrose with 10% glycerol'로 washing하라고 나와있는데 각각 오토클레이브 돌리고 0.5M sucrose와 10% glycerol을 얼만큼 pelet에 넣어서 resuspend하는지 이해가 가지 않습니다ㅜ (파일 첨부하였습니다)   그리고 G+프로토콜 찾아보면  - 0.5M sucrose만 사용해서 CC만드는 방법 -10% glycerol만 사용해서 CC만드는 방법 - 0.5M sucrose와  10% glycerol 같이 사용해서 CC만드는 방법 이렇게 크게 세가지 인것같은데, 그냥 방법이 3가지인것인지   아니면 Staphylococcus는 0.5M sucrose로 사용, TSB로 키운 CELL은 10% glycerol만 사용 이런식으로 균주별, medium별로 분류되는것인지도 궁금합니다.