vector 와 insert에 enzyme cut 진행 후 ligation을 진행할려고 하는데요 2개의 enzyme를 사용하다 보니 gel 상에서 band가 2개가 나오긴 하는데 이걸 제가 원하는 size부분을 gel extraction으로 자르고 ligation을 진행하는 걸까요? 아님 그냥 진행하는 걸까요?

람다파지를 이용한 유전자클로닝부분 공부하고있는데요 cos서열이 람다파지 genome의 circular form 형성에 관여한다는건 알고있는데  스샷 설명글을 보면 'cos 자리가 손상된 람다 DNA를 숙주에서 증식하여~'라는 부분이 있습니다. cos자리가 왜 손상되어야 하는지 궁금합니다. 의미가 와닿지가 않아서요....

TA cloning한 plate에서 30개의 colony를 골라 5개씩 묶어 colony PCR하였습니다. 일단 30개를 mini prep을 위해 culture를 시작하긴 하였는데,  첨부파일 같은 결과를 얻었습니다. 혹시 6개 section 모두 되었다고 봐도 될까요? QPCR inner primer로 PCR했을때는 5,6번에서 vector size 정도의 band가 나오고 있어서 이게 된건가 싶기도 합니다. 고수님들의 의견을 부탁드립니다.  

vector, insert, t4ligase 등 모두 문제 없는 걸로 확인되었는데요, cloning 후 확인을 위해 restriction enzyme으로 잘라보면 insert사이즈의 밴드가 안나와요ㅜㅜ 원스텝으로 진행되는 실험이라는데 몇번을 해도 cloning이 안됩니다. 어떤 부분에서 문제가 생긴걸까요?

gRNA는 제가 원하는 site 부분만 바꿔서 계속 재사용 될수 있다고 알고있는데요. site (20bp) 부분 뒷쪽에 Reverse primer 5` end에 phosphorylation이 붙은 primer를 이용해서 원하는 site (20bp) 앞쪽 프라이머만 바꿔준다라고 이해하고있는데요. 그럼 원하는 site를 바꿔줄때 site 앞에 부분 서열에 원하는 서열을 넣고 phosphorylation 프라이머와 같이pcr돌리고 dpn1 처리만 하면 되는건가요?

벡터맵을 보면   Hinc II,  Sac I, Acc I 3개가 GTCGAC를 인식한다고 표시되어있는데   이게 Isoschizomers 라는 건가요?  

고등학생인데요, 이전에 과기원에서 애기장대에 특정 유전체를 넣어 노화 억제를 확인하는 실험을 진행했습니다.  과정에서 개념적으로 헷갈리는 부분이 있습니다.. 처음 gis cloning 단계에서  promoter sequence pcr을 진행하고, floral dipping을 했고 Tdna insertion 단계 막판에 T dna insertion line을 pcr 했는데 .. 대체 두개가 무슨 차이인건가요ㅠㅠ gdna 안에 tdna가 일부 포함된..? 그런 느낌인가요? 실험단계명에는 t dna insertion line phenotyping이라고 되어있는데, gene cloning 개념에서는 '식물체의 전체 DNA를 제한효소로 절단시킨 Genomic DNA를 플라스미드, 박테리오파지 등 유전자 운반체인 vector에 부착시켜 박테리아나 기주세포에 도입한 다음 박테리아나 세포의 증식과 더불어 도입한 특정 유전자를 대량 증식시키는 것' 이라 되어있어서... tdna와 gdna는 아예 다른 것으로 봐야할까요..? 결과적으로는 애기장대에 Genomic DNA를 삽입한것으로 말해도 되는지 궁금합니다 ((전반적인 cloning 과정에 대해서 설명해주실수있나요..? pcr이나 electroporation같은건 다 알고있는데, 처음 prep한 유전자가 뭔지, 그 전후로 어떤 유전자를 주입한것인지 디테일한것을 잘 모르겠어요 검색해도 잘 안나오고.....))  

형질전환과정에서 궁금한게 생겨서 질문들비니다 컴셀에 kanamycin저항성이 있는 백터를 섞어주고 ice에 30분 반응 후, 42도에 90초 heat shock하고나서, 얼음에 1분박고, LB media에서 1시간 배양하는데 근데 1시간 배양할때, 그냥 LB media를 써야하나요 아니면 LB+kanamycin media를 사용해야 하나요? 그냥 LB media를 계속 써왔는데 궁급해서 물어봅니다

TA cloning 진행 중인데,  X-gal 도포한 plate에서 white colony가 떠서 sequencing을 보냈는데 공백터로 나옵니다. 왜 그럴까요? insert 농독가 단단위대로 낮기는 했는데, 그래도 molar ration 맞추어서 넣은건데 그렇습니다.    

유전자 클로닝을 할때 벡터에 삽입하기 위해서 EcoRi로 제한효소 처리를 하잖아용   처리하고나면   5'-G         AATTC-3' 3-CTTAA          G-5'   이렇게 약간 좀 복잡하게 되잖아용?     근데 T-벡터라는 녀석은 ..... 벌어진 부분에 T만 한 개 달랑 추가된건데,   점착성 말단보다 모양이 훨씬 더 간단해보이는데....    T-벡터만 쓰면 되는거 아닌가요?   실전에선 다들 T벡터만 쓰게되나요??

안녕하세요. 제가 ligation product를 가지고 DH5a에 형징전환 후 콜로니 6개를 따서 colony pcr을 했습니다. 그 후 전기영동으로 결과를 확인했는데 6개 중에 3번 콜로니만 밴드가 나왔더라구요. 근데 교수님께서 하나만 나온게 이상하다고 다시 한번 pcr하라고 하셔서 다시 pcr후 전기영동 했습니다. 1번때 pcr 결과 (3번콜로니만 밴드 확인됌.) 2번째 pcr 결과인데, 1,3,4,5번 콜로니에서 밴드가 나왔습니다. 이번엔1,3,4,5,번 콜로니가 밴드가 나오더라구요.  근데 저번에 밴드가 하나 나왔던 3번이 제일 진했고, 나머지는 밴드가 연하게 나왔습니다. 혹시 농도가 다른 이유가 있을까요? 콜로니는 모두 똑같이 따서 pcr 했습니다. 2번째 pcr결과(3번 만고도 1,4,5번 콜로니에서 밴드 확인됌.)

안녕하세요  제한 효소 반응을 통한 클로닝 과정에 궁금한 점이 있어 글을 남깁니다. 제가 기존에 두 종류의 enzyme을 사용하였을 때 버퍼 조성이 맞아서 두 enzyme을 동시에 반응을 시켰는데요, 요번에 사용하고자 하는 enzyme들은 동시에 반응 시키지 못해 한번 반응시키고 끝나면 다른 enzyme으로 반응 시켜야 할 것 같습니다. 그럼 이때 한번 enzyme으로 자르고 나서, gel purification을 하고 또 enzyme으로 자르는 것인가요? 아니면 enzyme 반응이 끝난 샘플을 원심분리해서 상층액을 제거한 다음 다른 enzyme(+ buffer)를 넣어 반응시켜주는 것인가요?   제가 생각하기엔 하나의 반응이 끝나면 그 tube안에는 DNA+buffer+DDW로 인해 volume이 많을 것 같은데 아무래도 그 tube에 다시 enzyme과 buffer를 넣어주는 것은 아닐거 같아서 여쭈어봅니다. 답변을 위해 시간 내어주셔서 감사합니다.

안녕하세요 클로닝 실험 순서에 대해서 여쭤볼려고 합니다. overlapping을 통해서 만든 insert를 cloning 하려고 하는데요. 순서가 맞는지 궁금해서 여쭤봅니다. (insert) pcr purification -> enzyme cut (overnight) -> gel extraction (vector) enzyme cut (overnight) -> CIP 처리 (2hr) -> gel extraction ligation (insert,vector) RT 2~3hr 혹은 16도 overnight -> E.coli transformation

 안녕하세요, Gene cloning시 NCBI database와 나의 실험생물에서 꺼낸 유전자의 sequence가 애매하게 다를때 어떻게들 하시나요 ??  예를 들어, nucleotide 한개가 바뀌어있어서 amino acid가 한개 바뀐다거나 하는 경우가 더러 있더라구요..   또 다른 경우는 Gene을 cloning한 vector clone 3 개 정도를 sequencing 하였을 때, 각각의 clone의 유전자 염기서열이 다를 때도 있더라구요 이런 경우에는 다들 어떻게 하시는지 문득 궁금해서 질문드립니다.   읽어주셔서 감사합니다. 오늘도 행복한 하루되시길 바랍니다. 

  가운데 자주색 부분이 플라스미드에 삽입하고자하는 외부 DNA인데요 자주색 부분 양 옆을 보면, 벡터에 삽입을 하기 위해   점착성 말단과 상보적인 서열이 달려있습니다.(5' -> 3' AATTC)   근데 한 가지 의문점이 생겼습니다. 넣고자하는 외부DNA 서열 옆에 AATTC가 우연히 달려있을 확률은 1/4^5인데   저 조건을 만족시키는게 어렵지 않을까요?   아니면 제가 뭔가 잘못 이해하고 있는 것인지...   제대로 이해하고 있는 것이 맞나요?

E.coli에 자체 plasmid가 존재하지 않나요? 그럼 com cell에는 자체 plasmid가 존재하는 상태로 cloning 과정을 통해 vector를 삽입하는 건가요? 아님 따로 처리를 한 후에 사용을 하는 건가요?

안녕하세요. 제가 DNA cloning을 진행하고 있는데 문제가 생겨버렸습니다 ㅜ 먼저 자르지 않은 DNA를 Agarose gel 에 내려보면 각각의 위치에 뜨는 것을 확인할 수 있는데 이것을 제한효소로 컷팅만하면 흔적도 없이 사라집니다. 즉, 제한효소로 컷팅시 gel어디에도 흔적을 찾을 수가 없고 오직 마커만 보이는 상태입니다.  혹시나 해서 다른 사람이 해보기도 했는데 결과는 마찬가지였습니다.   1. 혹시 왜 그러는 지 이유를 알고 계신 분 있나요??   2. 이걸 해결하려면 어떻게 해야할까요?

안녕하세요 cloning을 배우고있는 학부생이라 개념에 대한 이해가 알쏭달쏭해서 질문드립니다 제가 넣고자 하는 insert vector, backbone vector를 가지고 cloning을 하려는데요 backbone을 insert에는 존재하지 않는 2개의 enzyme를 이용해서 cut 한 후 insert에 위에서 사용한 enzyme를 넣은 primer를 제작 한 뒤 cut한 다음 PCR해 준 후 template를 가지고 ligation을 진행하면 되는걸까요? 근데 dpn1처리를 해야된다라는 말을 듣기도 해서요. 메틸화를 처리해주는걸로 알고있는데, 어떤 step에서 왜 해야되는지가 헷갈려 질문드립니다.

안녕하세요 cloning을 배우고있는 학부생이라 개념에 대한 이해가 알쏭달쏭해서 질문드립니다 제가 넣고자 하는 insert vector, backbone vector를 가지고 cloning을 하려는데요 backbone을 insert에는 존재하지 않는 2개의 enzyme를 이용해서 cut 한 후 insert에 위에서 사용한 enzyme를 넣은 primer를 제작 한 뒤 PCR해 준 후 template를 가지고 ligation을 진행하면 되는걸까요?

필요한 Mutant gene을 DH10bac competent cell로 trasnformation해서 white colony mini prep한   bacmid DNA . 사이즈가 많이 큰데 쉽게 잘 손상되는지요?  bacmid dna는 냉장보관하라는데 얼리거나하면 안된는 건가요?  보관할때 특별히 주의할 게 있을까요?