최근에 Y2H를 위해서 yeast transformation을 하고 있습니다. electroporation을 사용해서 2가지 DNA를 넣고있는데 분명 방법은 간단한데 효율이 문제가 아니라 애초에 colony조차 안나오네요 여러가지 해결법을 찾아보다가 의문이 들어서 질문남깁니다. electroporation원리상 세포막이 느슨해지면서 플라스미드가 들어가는걸로 알고있는데 그러면 기존에 들어가있던 플라스미드가 다시 나올경우는 없는건가요. 그리고 현재 plate에서 선별된 colony를 이용해서 transformation을 하는데 이럴경우 기존 competent cell을 만들어서 transformation하는 방법과는 다르게 봐야되는게 맞을까요 교수님께 나름 트러블슈팅 해서 갔는데 그건 컴셀이용해서 할때는방법이라고 하셔서 두개를 다르게봐야되는지 의문이 생겼습니다. 아직 지식이 부족한 대학원생에게 가르침을... ㅠ

안녕하세요   Lentivirus를 이용하여 RFP tagging을 진행하려고합니다.   제가 한번도 진행해본적이 없는 실험이라... 이러한 재조합된 repoter를 어떻게 제작해야하는지 잘 모르겠습니다...ㅠ   혹시 관련 사이트나 관련 정보를 확인할 수 있는 곳이 있을까요?  

안녕하세요.   현재 열심히 대학원을 다니며 여러가지 실험을 배우는 학생입니다.   현재 제가 수행해야하는 실험 중에 신경세포 중 GABAergic neuron을 RFP로 tagging을 해야하는 실험을 진행하고 있습니다. 논문을 찾아보니 보통 iPSC 상태에서 lenti-virus를 사용하여 RFP를 tagging하는것으로 확인했습니다.   제가 아직 이 분야에 대해 아무것도 아는바가 전혀 없어서 너무 막막한상황입니다.   먼저 transduction을 하기 위해서는 promotor를 제작해야하는것으로 알고있는데 어디서 부터 어떻게 준비해야할지 전혀 감이 잡히지 않습니다.    그리고 기본적으로 promotor를 제작했다고 가정하에, 그 다음 protocol은 어떻게 진행해야하는건지도 궁금합니다.   제가 아직 입학한지 1년도 채 안된 새내기 대학원생이라 그런지 논문을 검색해도 제대로된 프로토콜을 찾지도 못하고있네요 ㅠ   프로토콜을 좀 익힐 수 있는 논문이나 도움이 될만한 사이트가 있을까요?ㅠ

LB BrothㅡNaCl,trypton,Yeast 로 제조하는데 Trypton대신 Pepton써도 되나요?

(Colony 수) x transformation 총량(μl)/plate 도말량(μl) x 1/사용한 vector양(μg) 방법으로 efficiency test 진행하고 있습니다. 실험에서의 값들을 넣어보면 605(CFU) x 100μl/360μl x 1/0.1μgdl 이 나와서 값이  1680.55CFU/μg가 나오게 되는데요, 이것이 어떤것을 의미하는 건가요? competent cell의 효율이 이정도 나오면 적당한 수준인가요? 레포트에는 1680.55CFU/μg이라고만 쓰면 되나요? 다른 글들에는 막 10^7 이런것도 적혀져 있어서 이게 맞나 질문드립니다ㅠ

대학교 과제 관련 질문입니다. competent cell 제작 후 vector를 넣어 transformation 한 후 Colony 수 X transformation 총량(ul)/plate 도말량(ul) X 1/사용한 vetcor양(ug) 식을 사용해 efficiency test를 해야합니다 이 때 colony 수를 셀 때 붙혀야하는 단위가 따로 있나요?    예) 55개, 55cfu ( cfu는 조원님이 말하신건데 이게 맞나 궁금합니다.) 등..  

RBC에서 나온 HIT com.cell 사용 중이고 non-heat shock이 가능하길래 아래와 같은 실험방법대로 진행했습니다.    1. ligation 된 product 6.5uL + CP 65uL ->1초 vortexing 2. ice에서 10min incubation  3. 10분간 데워둔 kanamycin plate 에 spreading  4. 17hr incubation(37도)   총 6개 plate의 TF를 진행하였고, 총 3분류로 결과가 나뉘었습니다.  A : 콜로니가 잘 뜸  B : 콜로니가 1~3개 뜸  C : 아예 안뜨는 plate   제 생각에 주된 원인으로 1. ligation 시 넣는 시약들이 소량이라 들어간지 안들어갔는지 하는 것 2. heat shock을 안해 제대로 transformaton이 되지 않았다.  3. spreading 시 일회용 spreader를 사용하는데 너무나도 뻑뻑하게 밀었다.    왜 이러한 결과가 나오는지 잘 모르겠네요ㅠㅠ 선생님들 조언 좀 부탁드립니다.

실험 중에 TS(Temperature sensitivity) 배지에서 자란 colony로 transformation을 진행하였는데요.. TS배지가 plasmid curing과 관련이 있다고 하는데,, 정확히 어떤 원리인지가 궁금합니다 ... 구글에 서치해봐도 이해가 잘 안 가서요 .. 온도를 높여도 curing이 잘 되지 않게 하는 것인가요 ,,? 아시는 분 있으시면 답변 부탁드립ㄴ다 ... 

보통 competent cell을 만들때는 항생제를 넣지 않는다고 배웠는데요. 제가 plasmid가 들어있는 competent cell을 만들려고 seed culture때 항생제를 넣고 키워 100ml로. transfer해서 컴셀을 제작하려고 하는데 이럴땐 항생제를 넣고 컴셀을 만드는게 맞는걸까요?

사용하는 DNA 양이 부족해 quick transfromation을 하라고 지시를 받았는데, 구글링 해 protocol 을 찾아보니  DNA(100~500ng) + comcell -> ice 20분 -> 45초 heat shock -> cooling(2분) -> spreading 하라고 지시되어있던데, 그 일반 TF 에서 사용하는 S.O.C media는 quick에서 안 넣어도 되는건가요? 딱히 회복시킬 필요가 없으니?

제가 이번에 실험을 하나 하게되었는데 처음으로 하는거고 시간이 조금 부족해서 급하게 끝내야되는 실험입니다.. 우선은 특정 protein에 GFP가 붙여져 있는 상태로 assembly가 되는지 확인을 해봐야하는데  그럴라면 우선 벡터에 그 특정 유전자 옆에 GFP가 붙어있는것을 구매해야되는데 그걸 못찾겠습니다... 저랑 비슷한 실험을 하는 논문들을 찾아봤지만 거기에는 그냥 gift from 누구누구라고만 적어놔서 어디서 구매했는지는 찾아볼수가 없고 addgene 같은곳에 들어가도 안뜨더라고요... 그렇다고 그 논문 저자분한테 뜬금없이 어디서 구매한거냐고 이메일을 보낼수도 없고 제가 직접 만들기에는 너무 시간이 오래걸리고 준비과정도 오래걸려서 그냥 벡터만 사서 transformation만 진행할려 했거든요... 혹시 벡터를 구매하는데 제가 원하는 유전자 옆에 GFP가 달려있는걸 살려면 검색창에 유전자이름 치고 GFP를 치는게 맞는건가요..??   또 하나 추가적인 질문을 올린다면 Protein 하나만 보는게 아닌 두개를 봐서 두개가 서로 assembly를 하는지 확인을 하는건데 그럴라면 형광을 보기위해서는 GFP하나랑 mCherry 같은걸로 이렇게 하나의 세포에 두개를 transformation 시켜야되는거겠죠..? 처음하는 실험이라 이상한 질문이더라도 양해부탁드립니다ㅜㅜㅜ 

ligation 후 E.coli competent cell 에 transformation을 진행 후 ampicilin plate에서 키운 후 overnight 된 뒤 plate를 확인해보면 콜로니가 골고루 plate에 뜨는게 아니라 가운데 콜로니 하나에 주변에 콜로니가 모여서 뜨는 현상이 나타납니다. 냄새도 오염된거 같은 냄새가 나고요. competent cell이 문제인가 싶어 바꾸서 진행해도 똑같은 현상이 일어나서 질문드립니다. 제가 ligation 시 vector와 insert의 농도를 잘못 계산하여 진행해서 이런 현상이 발생하는것인지, 아니면 실험과정에서 오염이 발생해서 이러한 현상이 나타나는것인지 궁금해서 여쭤봅니다

TA에 ligation 하고 transformation 진행 한 후 prep 해서 Enzyme cut 해서 확인했는데 밴드가 5~6kbp 하나 750정도에서 하나 떠요. 이상한건 제 insert 가 750 정도라 괜찮은데, TA vector가 2.7kbp 로 알고 있는데 자꾸 그 두배가량 되는 사이즈가 확인되어서요. DH5a 에 TF 했고, T4 ligation kit으로 진행했어요

제가 pET32a vector를 transformation 까지 끝내고 LB 10ml씩 해당 vector의 항생제와 함께 키웠는데 잘 자라서 현재 4°C에 보관중에 있습니다. 이것을 stock 잡아 놓으려고 하는데 어떻게 해야 할 지 잘 모르겠습니다.  보통 vector를 LB배지에 키웠을 때 stock하는 방법이 어떻게 되나요?

target DNA를 형질전환할때 competent cell 사용시, CC의 활성여부를 확인하기 위해 negative control 방법을 사용하려고 한다면  LB에 cc를 도말했을때 colony가 형성되는것이 맞나요? 즉, cc 도말하여 colony 형성되면 cc의 활성이 있다고 보면 되는게 맞나요?  

kanamycin 내성인 vector pET28a를 BL21에 transformation시키고 kanamycin 배지에 접종시켰는데,, control 로 ampicillin 내성인 pUC19를 같이 transformation시켰는데 kanamycin 배지에 접종했는데 둘다 집락이 형성되어 증식하였습니다. 이러면 혹시 항생제의 활성이 떨어진것일까요?