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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > Transformation
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Q. Ligation and transformation
TA에 ligation 하고 transformation 진행 한 후 prep 해서 Enzyme cut 해서 확인했는데 밴드가 5~6kbp 하나 750정도에서 하나 떠요. 이상한건 제 insert 가 750 정도라 괜찮은데, TA vector가 2.7kbp 로 알고 있는데 자꾸 그 두배가량 되는 사이즈가 확인되어서요. DH5a 에 TF 했고, T4 ligation kit으로 진행했어요
회원작성글 LSCB라  |  01.16
Q. vector stock하는 방법
제가 pET32a vector를 transformation 까지 끝내고 LB 10ml씩 해당 vector의 항생제와 함께 키웠는데 잘 자라서 현재 4°C에 보관중에 있습니다. 이것을 stock 잡아 놓으려고 하는데 어떻게 해야 할 지 잘 모르겠습니다.  보통 vector를 LB배지에 키웠을 때 stock하는 방법이 어떻게 되나요?
회원작성글 bio1296  |  01.16
Q. competent cell NC로 활성여부 확인
target DNA를 형질전환할때 competent cell 사용시, CC의 활성여부를 확인하기 위해 negative control 방법을 사용하려고 한다면  LB에 cc를 도말했을때 colony가 형성되는것이 맞나요? 즉, cc 도말하여 colony 형성되면 cc의 활성이 있다고 보면 되는게 맞나요?  
회원작성글 쮸빠찌에  |  01.02
Q. kanamycin 내성 균주 배양 관련 질문
kanamycin 내성인 vector pET28a를 BL21에 transformation시키고 kanamycin 배지에 접종시켰는데,, control 로 ampicillin 내성인 pUC19를 같이 transformation시켰는데 kanamycin 배지에 접종했는데 둘다 집락이 형성되어 증식하였습니다. 이러면 혹시 항생제의 활성이 떨어진것일까요?
회원작성글 예뿌니  |  2022.12.21
Q. Transformation가 잘 안 돼요ㅜㅜㅜㅜ 첨부파일
안녕하세요. 실험을 시작한 지 얼마 되지 않은 새내기입니다. Addgene에서 pJBEI-6410이라는 벡터를 구매했습니다. 벡터를 저장하기 위해 E. coli XL1-blue, DH5a에 transformation을 시도했는데 colony가 나오지 않았습니다..... Addgene에서 권장하는 DH10B를 사용하지 않아서 그런걸까요? 아니면 방법이 잘못된 것일까요? T.F 방법은 아래와 같습니다. 1.배양한 cell을 원심분리 후 상층액 제거, 0.1M CaCl2 1ml넣고 파이펫팅으로 살살 풀어주고 튜브의 7ml 선까지 0.1M CaCl2 넣은 후 얼음 속에 40분간 방치 2. 원심분리 후 상층액 제거 후 약간의 0.1M CaCl2넣고 살살 풀어준 후 2ul 플라스미드가 담긴 튜브에 100ul 넣은 후 15분 방치 3. 42도에서 48초 heat shock 후 바로 얼음에 10분 보관 4. LB 배지 100ul 넣고 37도 스탠딩 인큐베이터에서 배양 5. 플레이트에 도말
회원작성글 ggy  |  2022.12.10
Q. Transformation 효율이 너무 안좋습니다.. 저와 비슷한 경험 하신분 있으신가요??ㅠㅠ
안녕하세요 현재 대학원 석사 1년차입니다. 원래 게속해서 진행해온 cloning과 transformation이 8월달 부터 인가 뭔가 점점 이상해졌습니다. 저희가 기존에 만든 C-cell을 이용해서 계속해서 transformation을 진행했는데요, 8월달 부터 transformation을 한 이후에 mini-prep을 진행해온 결과 원래는 300-400ng으로 잘 나왔었는데 어느순간 갑자기 50ng으로 확 효율이 떨어졌습니다.(mini prep kit 사용했습니다.) 너무 이상해서 여러번 transformation도 해보고 배지도 다 바꾸고 새로 다 만들어서 했는데도 이상해서 C-cell이 문제겠거니 해서 다른 랩에서 얻어온 C-cell을 이용해서 transformation을 해본 결과 비슷하게 나왔습니다. 그래서 C-cell을 사서 새로 transformation을 했는데 다행히 colony가 잘 떠서 liquid culture을 진행했는데요, 아니나 다를까 또 mini-prep을 진행한 결과 50ng밖에 안나왔습니다...ㅠ 심지어 안자란것도 있습니다..ㅜ antibiotic marker는 ampicilin을 이용하였구요.. 새로 산 DNA가지고도 transformation을 했는데 하나도 자라질 않았네요.. 일단 저희 학교 내 실험실에서 해볼 수 있는 모든 경우의수를 다 해보았는데 도저히 돌파구가 보이지 않네요... 혹시 저와 같은 비슷한 경험을 해보신 분이나 problem solving하신 분들 있으신가요??ㅠㅠ 
회원작성글 또찌까까  |  2022.11.29
Q. yeast 형질전환에서 LiAC를 쓰는 이유
대장균을 형질전환시킬 때 고농도의 2가 양이온 (Ca2+)를 사용하는데, 효모의 형질전환에서는 대부분 리튬 아세테이트를 쓰는 이유가 있나요?   리튬은 1가 양이온인테 어떤 차이점이 있나요?
회원작성글 bbboo  |  2022.11.28
Q. ampicillin배지에 transformation cell을 키웠는데 satelite가 많이 나와요...
전기천공법으로  plasmid를 transformation하고 다음 날 확인했는데, 크고 하얀 콜로니 주변으로 자잘한 콜로니들이 에워싸듯이 몰려있거나 아예 하얀 콜로니들을 뒤덮고 있었습니다. 지금 저 이상한(?) 콜로니들을 새로 만든 amp 배지에 streaking 하면 순수한 transformant만 얻을 수 있을까요? 아니면 다시 transformation부터 다시 진행해야 할까요? *배지는 알아보니 만든지 좀 되었더군요... 일단 저도 앞으로 쓸 일이 있을거 같긴 해서 새로 만들었습니다.    
회원작성글 란란루  |  2022.11.24
Q. Transformation bead
Transformation 할 때 bead로 굴려서 spreading 하는데 이때 노하우가 있을까요? colony가 자꾸 잘 안떠서... shaking하다가 cell들이 많이 죽을 수 있는지, 어느정도 해야될지 감이 잘 안잡혀서 도움 요청합니다..
회원작성글 쪼꼬만먼지  |  2022.11.24
Q. Theta replication 원리
Theta replication에 대한 기본적인 개념 혹시 설명해주실 수 있을까요? 논문을 찾아봐도 정확하게 나오지않는데.. rolling circle mechanism보다 좀더 stable하다 정도...
회원작성글 오월준  |  2022.11.18
Q. Transformation 계산 방법이 잘 이해가 안됩니다.
안녕하세요. Bacterial transformation 실험에 주력하고 있는 학부생연구원입니다. Transformation efficiency를 다른 논문에서 참고해서 계산을 하려고 하다보니, 대부분의 논문이 CFU/ug를 단위로 쓰더라고요. 이 단위의 뜻이 주어진 양의 competent cell에 DNA 1ug을 transformation 했을 때 생성되는 colony의 수라고 하는데, 다른 분의 의견으로는 Transformation efficiency면 사용된 competent cell의 전체 수에서 transformation된 세포의 수를 말하는 것이니까 transformation 후 spreading할 때 한 샘플을 selective plate와 항생제 없는 배지에 따로 키워서 항생제가 있는 배지에서 자란 콜로니 수를 항생제 없는 배지에서 자란 콜로니 수로 나눠야하는 것 아니냐는데, 그 말도 맞는 것 같아서요. 사실 transformatinon efficiency 정의를 봤을 때 잘 이해가 안되기도 하고요. 혹시 이것과 관련해서 이 공식이 어떻게 transformation efficiency를 설명하는 것인지.. 왜 CFU/ug을 unit으로 쓰는지 알려주실 분 계실까요?ㅜㅜ
회원작성글 dndb1303  |  2022.11.18
Q. Transformation 질문 부탁드립니다!
DH5a comp.cell에 transformation을 진행하다가 실수로 42도씨 heat shock 이전에 LB media를 먼저 1ml 넣어버렸습니다. 프로토콜상으로는 Heat shock 이후에 LB media를 넣고 recovery time을 줘야하는데 순서를 ㅂㅏ꿔 진행해버렸는데, Transformation efficiency에 크게 영향을 미치나요..?ㅠㅠ  
회원작성글 쪼꼬만먼지  |  2022.11.17
Q. BL21(DE3)로 transformation 하는데 basal level과 leaky하다는게 무슨 뜻이죠?
Lac operator가 basal level이 높고 leaky하고 leaky한 basal이 있어야 lac이 작동한다고 설명하시는데 무슨 소리인지 모르겠네여. IPTG, ptac으로 충분히 translation이 가능한데 T7을 이용하는 이유는 basal 생성이 줄어들며 leaky해져서 잘 안 자라거나 죽어서, 원할 때만 induce하게끔 하기 위해서이고 basal level에서 inoculation하는게 어떻고 T7 사용할 때 basal level이 거의 안 만들어지고 pLysS T7 leak을 없애면 copy 수가 줄어든다는데 뭔지 모르겠네요 ㅠ
회원작성글 생물인간  |  2022.11.12
Q. DNA ligation 및 transformation 과정 관련해서 궁금한 점이 있습니다.
안녕하세요 이제 막 실험수업 듣는 학부생입니다!   transformation 이후 Amp+plate에 배양하여 다음날 colony가 뜨는지 확인하러 갔는데 하나도 없었습니다. 물론 저는 transformation과정에서 생긴 문제라고 인지는 하고 있어요. (ex. CaCl2를 pellet에 녹일 때 pipetting을 너무 쎄게 했다던가, 스프레딩을 쎄게 했던가 등등..)   그런데 transformation을 하기 전에 insertDNA와 plasmid DNA를 ligation을 했는데 혹시나 이 과정도 transformation을 하는데 영향을 줄 수 있는지 궁금해서 질문 드립니다.   1:1 1:3 insert(약280bp) 약26ng/ul     vector(약4200bp) 약30ng/ul 2ul 2ul SDW     T4 DNA ligase 1ul 1ul 10X ligation buffer 2ul 2ul Total 20ul 20ul 실험할 당시 ligation 관련 protocol입니다. total volume과 10x ligation buffer, T4 DNA ligase의 volume은 고정해 두었고, vector는 농도 50ng/ul을 맞춰주기 위해 2ul로 진행하였습니다. (인서트와 벡터의 분자량과 농도는 대략적인 수치로만 나타냈습니다) 조교님은 인서트와 벡터의 ng의 비율만큼 넣는 방법을 알려주셨는데, 인서트와 벡터의 볼륨비로 해도 상관은 없기 때문에 볼륨비로 진행한다고 하셨고, 저희는 그대로 insertDNA를 각각 2ul, 6ul만큼 넣어주었습니다.   여기서 궁금한 점은..  10X ligation buffer의 볼륨을 2ul로 고정하는 이유가 무엇인가요? 1) 벡터와 인서트의 ng비로 1:1을 맞추면 인서트는 0.15ul정도만 넣어도 되는데 2) 벡터와 인서트의 볼륨비로 1:1을 맞추면 인서트는 2ul을 넣어야 하잖아요? 물론 ligation 반응하는데 있어서 인서트가 많을수록 반응은 잘 일어나겠지만 1번과 2번의 볼륨 차이는 약 13배나 차이가 난다는 건데, 반응하는 물질의 양에 따라서 buffer나 salt농도는 다르게 해줘야 하지 않나요? 볼륨비로 하던, ng비로 하던 1:1을 하던, 1:3으로 맞추던 간에 10X ligation buffer의 양은 달라야 한다고 생각하거든요. 따라서 ligation할 때 buffer 등의 salt농도를 제대로 맞춰주지 못해서 생긴 문제로 transformation할 때에도 영향이 어느정도 있을거라고 생각하는데..   물론 조교님이 알려주신 프로토콜에 문제가 있을거라고는 생각은 안하지만 제가 전공지식이 너무 부족하고 실험도 처음이라 이해가 안가는 부분이 너무 많네요 ㅠㅠ 도와주세요..
회원작성글 형준팍  |  2022.10.19
Q. plasmid transformation confirm 방법
integration된 균주는 colony pcr을 통해 integration의 유무를 확인할수있는데 plasmid를 transformation 진행한 colony는 잘 되었는지 확인을 할수있는 방법이 있을까요?
회원작성글 학헉학도생  |  2022.10.17
Q. integration 과 plasmid 차이
하나의 생성물을 발견하기 위해서 integration을 균주에 시키는것과 plasmid를 transformation시키는것 의 차이가 어떤건지 알수있을까요?
회원작성글 학헉학도생  |  2022.10.04
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