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BioLab 이은열 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > Transformation
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질문/투표/프로토콜 등록
Q. e.coli의 transformation
안녕하세요.   과제로 transformation에 관한 발표 주제를 받았는데요.   37도에서 키운 e.coli와 18도에서 키운  e.coli의 transformation efficiency를 비교했을 때 18도에서 키운 e.coli의 transformation efficiency가 더 높다고 합니다.   그래서 자료조사를 해봤는데 명확한 이유를 찾기가 힘들더라구요..   혹시 아시는분 있을까요?
회원작성글 아아아아아우  |  09.25
Q. transformation 후 dilution 하여 분주
transformation 후 dilution 하여 plate에 spreading을 진행할때 얼마나 dilution을 해야되는지 모르겠어서 질문드립니다. 보통 농도 몇짜리를 몇으로 희석해서 plate에 분주하시나요? 다른분들이 하는 예시를 알아야 제가 계산할수 있을거 같아 질문드립니다
회원작성글 겨율까지  |  09.20
Q. Transformation DNA 농도
Transformation 실험을 하는데, DNA plasmid 500ng/10ul 이 있는데,  Complete cell에는 DNA plasmid를 1pg-100ng 첨가 하라고 되어 있는데,  10pg를 첨가할려면 농도를 어떻게 희석 해야 할까요? ㅠ   또, DNA plasmid가 TE bfr에 담겨 있다는데, 희석은 DW로 해도 될까요? 
회원작성글 dhehfl  |  09.19
Q. E.coli competent cell GYT
안녕하세요 E.coli competent cell 제작 과정중 glycerol로 washing 과정을 거친후 GYT를 분주하는걸로 protocol이 알려져있는데 GYT를 넣어주는 이유를 알수있을까요?
회원작성글 겨율까지  |  09.15
Q. yeast amp plate
amp가 E.coli에서 colony selection을 하기위해 항생제를 넣어주는걸로 알고있는데요. yeast로 ransformation 과정을 진행중입니다 yeast 에서의 Amp plate도 같은 원리로 사용하는건가요..? E.coli에서만 amp plate를 꺼보고 YPD amp plate는 써본적이 없어서 질문드립니다.
회원작성글 겨율까지  |  09.15
Q. kanamycin 내성 균주 배양 관련 질문
sequencing 맡기려고 plasmid 추출부터 다시하려고 항생제 배지를 만들어 배양하는 과정입니다. 1) 균주중 한개는LBA-k에서 키워서 냉장고에 놔두었던 상태로 같은 LBA-k에 계대배양해 키우려고 했는데 자라지 않습니다. 계속 잘 자라오던 것이 자라지 않으니 균이 죽었다고 해야하는건지...
회원작성글 예뿌니  |  08.30
Q. confirm PCR 질문 드립니다.
vector를 균주에 transformation 시켜놓은 상태인데요. vector가 잘들어갔는지 확인하기 위해서 colony PCR, gDNA extraction 하여 confirm PCR을 진행하려고 합니다. 또한 master plate에 screening 시켜서 확인도 해야된다고 배운거 같은데요 이론은 알겠는데 transformation 시킨뒤 다음부터 어떻게 진행을 해야되는건지 잘 알지 몰라서 질문드립니다. transformation 시킨 colony를 pick하여 seed 후 competent cell을 제작한 후 해야 되는건지.... 다음 순서를 알고 싶어 질문드립니다.
회원작성글 석사해말아  |  08.21
Q. top10, XL1 blue
plasmid를 prep하려고 competent cell을 만들고 transforamtion을 하려고 하는데 둘의 차이가 있을까요?
회원작성글 인턴임다  |  08.20
Q. Miniprep 한 벡터 transformation이 안됩니다.
pDS132 계열 벡터를 S17-1 λ pir에 transformation하려 하는데.. 이 벡터에 cat이랑 nptI 유전자를 넣었습니다.. 이 벡터를 DH5a λ pir 에 transformation 했을 때, colony가 잘 떴지만, S17에서는 하나도 뜨지 않았습니다.. (heat shock transformation 하였습니다) C-cell 문제인가 싶어서 pRK415 벡터를 시험삼아 transformation 했는데 콜로니 잘 나왔구요.. 1. Km 100, Cm 20 plate 를 사용중인데 혹시 S17이 두 항생제에 민감한지.. 2. Heat shock이 잘 안되어서.. Electroporation을 하려 하는데 이 방법으로 콜로니 얻을 수 있는지 여쭤봅니다.
회원작성글 창의적인사람  |  08.15
Q. transfection을 통한 integration
안녕하세요, 현재 cell line 제작 중에 있습니다. virus를 이용해 transduction 시키려고 하는데요, 저희 교수님은 transfection을 이용해 integration 시키지 왜 virus를 만드냐는 말씀을 자주 하셔서요. 1. transfection을 통해서도 integration이 되는지 2. 된다면 virus을 이용할 때와의 차이점은 효율 뿐인지 3. 효율 차이가 많은지 에 대해 질문 올립니다.
회원작성글 science_  |  08.10
Q. lentiV2클로닝중인데 transformation이 안됩니다ㅠ
 comp cell은 DH5a를 사용중이고,  vector는 lentiV2를 이용중입니다 제가  primer 20bp크기를 insert하려는데 콜로니가 안떠서 고수님들께 자문구합니다.   DH5a는 RBC에서 구매해서 사용중이라 문제는 없는것같습니다. BsmB1으로 자르고 gel extraction 후 밴드 잘린거 확인했습니다.   comp cell 20ul에 plasmid 1.7ul넣고 transformation은 ice 20 min 42도에서 heat 45 sec ice 20 min 뒤에, S.O.C 50ul 넣고 37도  shake incubator에 1시간 배양 후  lb+amp plate에 모두 spread합니다   콜로니가 아예뜨지 않는데 어떤 단계를 확인하거나 바꿔야 할까요 vector도 바꿔보고 glass beads로  non-heat 으로도 해보고, ligation 단계에서 ATP도 넣어봤는데 콜로니가 안뜨네요ㅠㅠ  도움 부탁드립니다.ㅠ  
회원작성글 hihalo  |  08.09
Q. AVPR2 유전자 점돌연변이 제거 모의 실험 오류 확인
고등학생입니다. 신장성 요붕증의 원인인 AVPR2 유전자의 점돌연변이를 잘라내는 모의 실험을 계획했는데요.  10-23 DNAzyme을 이용해 제거하고 AVPR2 유전자의 점돌연변이 부분을 제거하여 제거가 잘 되었는지 확인하는 실험입니다. AVPR2 유전자 돌연변이로 280번째 아미노산이 치환되어 신장성 요붕증이 발생한 것이므로 ncbi에 들어가 정상인의 280번째 아미노산을 확인한 정상인과 신장성 요붕증 환자의 염기서열을 비교해 돌연변이 위치를 파악합니다. 그 후 이 돌연변이만의 10-23 DNAzyme를 설정하고 제대로 절단됐는지 확인하고자 AVPR2 유전자의 점돌연변이 mRNA 절단 여부를 판단합니다. 잘라낸 부분의 mRNA를 증폭시키기 위한 primer를 설정하고 전기영동의 각 Lane에 대조군인 AVPR2 유전자의 돌연변이 mRNA, AVPR2 유전자의 돌연변이로 인한 신장성 요붕증 환자의 DNA, 증류수를 넣는다고 가정했습니다. 실험군으로는 직접 설정한 DNAzyme을 이용해 돌연변이를 제거한 환자의 mRNA를 넣고 프라이머 등을 넣는다고 가정했으며 RT-PCR 후 전기영동을 통해 증폭 여부를 판단하여 가설의 성립 여부 확인으로 모의 실험이 종료됩니다. 이 모의 실험에서의 오류가 있을까요??
회원작성글 꺅꺅  |  08.08
Q. cell line 만들 때 transfection, infection 차이
안녕하세요, 특정 gene을 과 발현 시키는 stable cell line 제작 중입니다. 저는 보통 viral vector를 이용해 virus를 만들어 infection 시켜주는 방식으로 실험을 진행하는데요, 교수님께서 항상 왜 그냥 transfection해서 integration 된 cell을 골라내지 않냐고 말씀하셔서요. 지나가는 소리로 선배들에게 transfection을 하면 infection보다 효율이 안좋다 란 얘긴 들었고, transfection reagent는 핵막을 뚫지 못해서 division 되는 cell에만 들어가고 virus는 (lenti 사용) 핵막을 뚫는다, 정도만 알고 있는데 정확한 효율 차이 등을 아시는 분이 있으신가요? 답변 부탁드립니다 :-)
회원작성글 1461hj  |  08.05
Q. transfection 시간이 얼마나 될까요?
사람세포에 transfection을 하려고 합니다. 실험설계 상, plasmid를 먼저 넣고 그리고 siRNA로 KD를 해야하는데 siRNA는 48~72시간이 최적이라고 알고 있습니다. plasmid를 넣고 나서 효율이 몇 시간 정도 가나요? 아마 plasmid를 우선 넣고 24시간 뒤에 siRNA를 넣어 72시간 후에 cell harvest할 것 같습니다.
회원작성글 차몬드  |  07.31
Q. DNA gel 전기영동 밴드가 이상하게 나옵니다 ㅠㅠ
transformation 후 colony 확인하여 mini-prep 후  gel 전기영동 100v 30분 돌린 결과입니다. 위쪽은 DNA인게 확인되었는데 (크기 비교 결과 맞음) 아래쪽이 대체 무엇인지 모르겠습니다. ㅠㅠ - 1.2% LE agarose gel 사용했고, DNA 4ul+D.W 6ul+6X loading dye 2ul 총     12ul loading 하였습니다. - mini prep 결과 퀄리티는 오염없이 잘 나왔습니다. 제발 알려주세요 ㅠㅠ
회원작성글 실험천재  |  07.29
Q. electrocompetent com cell 제작
electrocompetent com cell 을 제작 중에 있습니다. 원래는 하루면 OD값이 원하는 정도까지 도달해야 하는데 절반이 안되게 자라는 상황입니다. method는 protocol대로 잘 지켰습니다. 원래는 좀 더 최적화를 하여 com cell을 만들어야 하지만 현재는 여건이 되지 않아서 혹시 배양 시간을 지켜서 그냥 만드는 것과 원하는 OD값까지 키우는 것 중 어떤 게 더 중요하다고 생각하시나요?? 제가 너무 기초가 부족하네요 ㅜㅜ 읽어주셔서 감사합니다.
회원작성글 너무어려워요  |  07.22
Q. TA cloning시 PCR product 사용
3.3kb와 3kb짜리 유전자를 pCR4-TOPO vector에 TA cloning kit를 사용해서 진행하고 있습니다. pcr product (농도는 약 300ng/ul)를 4ul + vector 1ul + salt 1ul  해서 30분, 4시간, 12시간, 16시간 이런식으로 다 해봤는데 콜로니가 아예 뜨지 않거나 엄청 많이 떴었습니다. 엄청 많이 뜬 경우에 blue colony가 아예 없을떄도 있었습니다 (이게 가능한가요) 콜로니가 너무 많아서 새로 긁어서 white colony를 m13 primer로 colony pcr했더니, 원래 나와야하는 곳은 적어도 3kb이상인데, 2kb에서 밴드가 많이 뜨는것을 확인했습니다.   pcr product extraction시 문제가 생겼나 해서 pcr product extraction한 것을 전기영동해봤더니 원래대로 3.3, 3kb에 뜨는것을 봤습니다. vector와 mixture를 만들때 문제가 생기는 것 같은데... 어떤 문제가 있을수 있나요? 도와주세요 ㅠㅠㅠ
회원작성글 ziw  |  07.05
Q. competent cell을 넣은 LB agar plate에서 곰팡이 폈을 때, 여기서 나온 colony 사용하면 안 되는거죠?
E.coli JM109로 원하는 plasmid DNA를 넣어서 LB agar에 어제 넣어서 24시간동안 incubation 했는데요. 제가 아는 colony와 함께 곰팡이가 폈습니다ㅠㅠ 이런 경우에는 colony 사용하면 안 되고 다시 시작해야 하는거죠? 곰팡이는 포자가 있으니까요....   LB agar plate를 22년 03월 28일에 만들어진 것을 사용했는데 그게 문제였을까요? Ampicillin 최종 농도는 참고로 100 ug/mL입니다. 항생제가 있어도 곰팡이가 자랐네요. 아니면... 현재 clean bench가 없어서 실험대 위에서 알코올램프 키면서 실험을 하고 있는데요. 그 과정에서 오염이 된 것 일 수도 있겠고요. 그것도 아니면....heating block 온도가 42도가 아닌 51도에서 1분 동안 heat shock해서 그런 것인지...ㅠㅠ   plate 가장자리 부분에 있는 colony는 picking 할 수 있는 사이즈인데...곰팡이가 폈네요ㅠㅠㅠ 휴우....ㅠㅠ
회원작성글 아스널  |  06.30
Q. vector transforamtion
안녕하세요. vector transformation 중에 문제 있어서 이렇게 질문을 남깁니다....   addgene에서 pMo130 vector를 주문해서 E.coli XL1-BLUE에 tansformation을 시도했는데....colony가 하나도 안 나왔습니다....... 그 이후에 vector의 양을 늘려서 한 번더 시도해봤는데...안 되네요.... 이 vector는 XL1-BLUE에 transformation하면 안 되는 vector인가요?? transformation할 때는 항생제로 kanamycine LB plate를 사용했습니다. 이게 잘못된 것은 아니죠??....... 사이트에 들어가면 JM109에 하라고 적혀있기는 한데....저희가 지금 그 균주를 구매할 수 있는 상황이 아니라서요.... E.coli XL1-BLUE 말고는 E.coli DH5a 만 있는 상태입니다... E.coli DH5a에 시도해보면 나올까요??.... cloning 고수님들 답변 부탁드려요....  
회원작성글 Worker  |  06.24
Q. plasmid vector와 host cell 항생제 질문드립니다.
안녕하세요. 찾아보니 알거 같으면서도 헷갈려서 이런 기본적인 질문을 드리게 되었습니다. 제가 사용하는 벡터는 pet28a이고 kan 저항성을 가지고 있습니다. 그리고 사용하려는 host는 bl21(rosetta)이고 cm 저항성을 가지고 있습니다. 배양시 kan과 cm 둘 다 넣어서 배양을 하라고 하는데 pet28a는 kan 저항성밖에 가지고 있지 않은데 kan, cm 둘 다 넣는 배지에서 배양을 하면 각각은 다 죽는거 아닌가요..? 항생제 하나 넣어서 선별하는건 이해가 되는데 double selection은 이해가 잘 안 되네요 ㅠㅠ 쉬운 질문이지만 답변 부탁드리겠습니다. 항상 감사드립니다.
회원작성글 기적  |  06.21
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