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BioLab 박소정 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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Q. FAM probe 형광 발현 문제,,,,
안녕하세요, 제가 하다하다 안돼서 이곳에 글을 남깁니다. 제가 얼마전부터 NTC 샘플에서 계속 형광이 증가가 되는 문제가 발생하고 있는데요, 처음에는 오염인줄 알고 시약도 다 새로 주문을 해서 실험을 계속 하고 있는데 여전히!!! NTC 샘플에서 형광이 선형적 증가을 하고 있습니다. 혹시나 해서 gel도 내려봤는데 당연히!!!! amplicon은 보이지 않고요,,,, Probe에 손상이 갔나해서 새로 주문을 하고 별짓을 다해도 계속 이런 문제가 발생하네요,,,, 사용하고 있는 Probe는 FAM-TAMRA 입니다,,,, 도대체 왜 그런지 작은 힌트라도 좋으니,,,PCR 고수님들 tip좀 주세요~~~~  
회원작성글 할까말까해  |  12.05
Q. 혈장 농축 방법 문의
안녕하세요. 혈장 내 존재하는 ctDNA를 이용하여 진단을 하려고 합니다. 전혈을 이용하여 혈장을 분리하는데, ctDNA 추출 제품에서 혈장을 사용할 수 있는양이 6cc로 한계가 있습니다. 전혈에서 혈장을 농축할 수 있는 방법이 있나요? (10cc 이상의 혈장을 농축하여 ctDNA를 추출하고자 합니다.)   좋은 방법이 있으시면, 답변 부탁 드리겠습니다. 감사합니다.
회원작성글 TSReQM  |  12.05
Q. mtDNA 추출
안녕하세요.  cell에서 mtDNA를 추출해 qPCR을 하려고 합니다. 사용 kit 는 DNeasy blood & tissue (qiagen) 사용 예정입니다. 제가 궁금한 것은 미토콘드리아 DNA 추출 키트를 사용하지 않더라도 추출이 가능할지가 궁금합니다. 혹시 사용해보신분들 계신지 여쭤보고 싶습니다.
회원작성글 똑똑해지자  |  12.05
Q. PCR 초보 질문입니다ㅠㅠ
PCR을 돌리고 나서 전기영동하고 나면 300bp 또는 500bp에 밴드가 나옵니다 근데 여기서 long pcr밴드를 확인하고자 할때 pcr reaction mix의 람다dna양을 늘리는건가요? 아니면 primer를 더 긴 길이로 바꿔줘야하는건가요?
회원작성글 호로롱슝  |  12.03
Q. pcr 밴드보는법?
3번염색체에 위치한 STR마커인 D3S1358 marker를 이용해서 구강상피세포로 PCR진행했는데요.. 결과가 이렇게 나왔는데 1.이때 PCR product의 크기는 약125bp, 130bp, 약170bp, 180bp 이렇게 총 4개 나온거 맞나요?? 대립유전자는 2개라서 2개만 나와야하는거 아닌지,,왜 4개가 나왔는지 아무리 생각해도 모르겠습니다ㅠㅠ   2. 여기서 각 allele의 빈도를 알고싶은데 이때 각 allele라는게 1번에서는 125,127/ 170,180 이렇게 4가지 밴드를 각 allele라고 보는게 맞을까요?(이게맞다면 allele가 4개가 있는건가요>) 아니면 125,127 이거가 한 유전자의 allele이고 170,180이게 또 한유전자의 다른 allele라고 보는게 맞는건가요?
회원작성글 갈색솜뭉치  |  12.02
Q. overlap pcr
vector에서 50bp만 원하는 gene으로 바꾸기 위해서 pcr을 진행했는데 원하는 원래대로 라면 3kb의 band가 나와야되는데 pcr만 하면 700bp가 나와서 원하는부분에서 pcr이 된거같지 않아 overlapping pcr로 이어 붙여 만들려고 합니다. 제가 overlap은 처음이라 궁금한게 많아 질문드립니다. 1. 지금 제가 가지고 있는 vector가 circular인데 우선 이걸 linear로 자르고 시작해야되는건가요? 2. 제가 원하는기존에 있던 gene이 아닌 원하는 gene을 넣어주기 위한 pcr fragment, 기존에 잘라서 이어붙이는 fragment부분 해서 2개를 이어붙이는건지… 아니면 기존 circular를 2개의 fragment로 잘라서 총3개의 fragment를 이어붙이는건지 질문드려도 될까요?
회원작성글 얼마안남았다  |  12.02
Q. PCR시 100bp이하의 band 검출 관련입니다.
PCR을 했는데 원래 detect 되어야하는 size에서는 band가 안나오고 2번째 line과 같이 100bp 이하에서 band가 나왔습니다... 다른 유전자가 검출된 건가 싶어 Gel extraction, TA-cloning후 prep 해서 sequencing을 보냈는데 결과에서 다른 유전자가 아닌 T-vector로 나옵니다. 이유 알고계신 분 있으시면 꼭 답변 부탁드립니다 ㅠㅠ 감사합니다.  
회원작성글 Cheddar  |  11.30
Q. 전기영동 실패 원인
정상적으로 결과가 나왔다면 band가 저것보다 훨씬 짧아야 했구요 ㅠㅠ band 휘어짐이 너무 심합니다 이유가 뭘까요? 아가로스 겔은 조교님이 만들어주신 1% 짜리로 했습니다 
회원작성글 옥수수엄마  |  11.26
Q. Site-directed mutagenesis 안되는 이유..
  안녕하세요.. 현재 Site-directed mutagenesis를 하고있는데 colony가 안떠서 난항을 겪고 있습니다..   vector 전체 size는 3.5kb로 작은 편이고, primer design은 다음과 같이 C ▶ T로 바꾸는 것을 목표로 하여, 33mer 로 design 하였습니다.   snapgene 상에서의 Tm값은 63도로 계산되나, 사실 primer 자체는 Agilent quickchange webdesign tool로 design 한 것입니다.    Agilent quickchange protocol은 annealing Tm 값을 55도 기준으로 한다는데.. 무튼 protocol은 다음과 같이 하였습니다..   PCR mixture : total volume 50ul (high fidelity Pfu)에 template vector 200ng PCR cycle :    95°C 30s 95°C 30s 55°C 60s 68°C 2:30s (1kb/30s로 조금 넉넉하게 줬습니다.) step 2부터 X 18  68°C 13:00   PCR이 완료되면, 바로 PCR product에 DpnI 1ul 넣고 37°C 에서 6h incubation    그리고 com-cell에 heatshock 주고, 1ml plain LB에서 40min 돟안 shaking incubation   마지막으로 1ml LB culture medium centrifugation 하여, 가라앉은 com-cell pellet과 soup조금만 남기고, 적당히 pipeting하여 suspened하게 만들고 Amp(marker입니다.) plate에 spreading       제가 예~전에 해당 protocol로 했을 때는 잘 했었던것 같은데, 그때랑 달라진건 polymerase 종류 (회사) 정도? 그래서 사실 high fidelity Pfu 다른 회사 2종류로 test 해봤는데도 역시 안뜨더군요..   무엇이 문제일까요...   선생님들의 지식을 조금만 나누어주시면 감사드리겠습니다.. ㅠㅠ
회원작성글 neuronal p..  |  11.24
Q. assembly PCR
안녕하세요 assembly PCR이 너무 안되어 질문 올려봅니다... 두 gene을 10cycles을 돌려 assembled fragment를 확보하고(gel extration도 이용해봄) 다시 primer를 넣어 amplify를 시도하는데 계속해서 원래 두 개의 gene이 분리되어 나옵니다.. method의 문제로 일어나는 일 일까요?  첫번째 사진이 10cycles 후 사진이고, 두번째는 첫번째의 네모박스 사이즈의 dna를 gel extraction으로 분리 후 primer와 함께 amplify 한 사진입니다      
회원작성글 CYS  |  11.24
Q. cDNA 합성에서 헷갈리는 부분이 있습니다.
RNA template에서 oligo dT나 random hexamer와 Reverse transcriptase를 사용해서 RNA-DNA helix를 생성하고 RNase H를 사용해서 RNA만을 분해한 다음(ssDNA만 남고), DNA polymerase로 dsDNA로 합성해준다고 알고 있습니다. 그런데 여러 회사에서 파는 cDNA 합성 kit에는 왜 DNA polymerase가 없는 건가요? 그냥 RNA-DNA helix를 PCR에 사용하는 건가요?   그리고 저희 실험실에서는 Bio-RAD의 iScript cDNA synthesis kit를 사용하는데, 여기서 제공되는 RT는 RNase H+라고 하더군요 근데 RNase H는 RNA를 분해한다고 하는데, 그럼 최종 합성 prouct가 sscDNA로 남는걸까요?  
회원작성글 ziiion  |  11.23
Q. pfu polymerase로만 뜨면 안떠집니다
안녕하세요 현재 cloning을 하기 위해 PCR을 진행하고 있습니다. 3,600bp 정도 되는 insert를 PCR 뜨고 있는데 문제는 pfu pol이 아닌 그냥 taq pol을 써서 뜨면 잘 떠지는데 pfu pol로 뜨는 순간 바로 밴드가 안뜨더라구요.. 아무래도 3.6kb 정도 되는 insert를 따다 보니 막택으로 뜨면 잘 떠지더라도 sequencing을 해보면 point mutation이나 deletion이 되어 있더라구요.. 그래서 pfu pol로 뜨고 싶은데 같은 회사 polymerase라도 pfu냐 taq이냐 에 따라 안떠지는데 이럴 땐 어떻게 해야하나요ㅠㅠ
회원작성글 파채부락리  |  11.22
Q. HXT5에 대한 real time PCR을 진행할 경우,,? 궁금한거 있습니다ㅠㅠ
SCR1, TKL2, REI1에 대한 cDNA를 합성하였다고 가정하였을때 만약 전혀 다른 유전자인 ‘HXT5’에 대한 real time PCR을 진행할 경우에는 어떤 실험결과가 나올지 분석하려고 하는데,,, 여기서 궁금한게 앞서 합성한 SCR1, TKL2, REI1유전자는 HXT5 유전자의 RT PCR 결과와는 완전 무관한거 아닌가요??ㅠㅠ 그냥 독립적으로 HXT5 유전자에 RTPCR결과만 놓고 보면 되는거죠??   
회원작성글 갈색솜뭉치  |  11.21
Q. Pcr 안될때 workflow
대부분 rt pcr 이나 pcr을 할때 사실 저는 primer tm값이나 cycle 조건을 따지지 않고 annealing 58도 30초 72도 30초 이렇게 35cycle 로 돌려버리는 편이고 Bioneer accupower premix 로 우선 돌려봤다가 안나오면 phusion plus 로 해보면 왠만하면 나오더군요 근데 문제는 저렇게 해서 안나오는거는 뭐부터 바꿔야되는지 앞이 안보이더군요 그래서 혹시 pcr 이 안될때 어떤 workflow 를 가지고 실험을 하시는지 궁금하고 또한, 자주쓰는 polymer 나 회사 같은거 추천해주시면 고맙겠습니다
회원작성글 오미자랩  |  11.21
Q. DNA 관찰 UV 파장
DNA, RNA 등을 EtBr과 유사한 SafeView로 염색해서 agarose gel에 로딩해 관찰하고 있습니다. UV transilluminator를 구매하려고 하는데, 모델이 365nm랑 312nm로 두 가지가 있습니다. 두 모델 가격 차이도 좀 나는데, 두 파장 중 어떤 것이 더 맞는지 잘 모르겠습니다. 사용하는 SafeView는 흡광 파장이 490~265nm입니다.  
회원작성글 차몬드  |  11.17
Q. pcr template
안녕하세요 현재 대학원에서 인턴을 하고있는 학부생입니다. 문득 선배님들이 하시는 pcr을 보고 template을 어디서 얻어오는건가 궁금해서 질문을 남기게 되었습니다. gRNA, cloning 할 vector에 들어가는 유전자 부분을 가지고 오기위해서 primer를 제작한다는건 이해가 가는데 거기에 들어있는 유전자들은 어디서 가져오는건지 따로 primer처럼 주문해서 제작하는건지 여쭤봐도 될까요?
회원작성글 얼마안남았다  |  11.15
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