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BioLab 이은열 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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Q. Dna methylation 확인 실험 계획
고등학교 1학년이고 학교에서 예산을 받아 dna 메틸화 관련 탐구를 진행하려고 합니다 그래서 dna methylation 확인 실험을 해보려고 하는데 검색을 해봐도 방법을 찾지 못하겠어서 질문을 하게 되었습니다 Dna methylation 확인 실험 중 bisulfite conversion 로 계획하고 있습니다! 방법이나 혹은 참고할 만한 사이트 있으면 알려주시면 감사하겠습니다
회원작성글 다음  |  09.22
Q. rt-qPCR prep과정 시 rna추출량이 너무 적어요ㅠ
안녕하세요 rt-qPCR prep을 하고 있는데 RNA추출량이 너무 적게 나와서 문의드려요.. 일단 24well plate에 RAW 264.7 cell을 10^4cells/ml씩 seeding한 후 단백질을 treat 한 후 5일 째 되는 날 prep 진행하였습니다. prep 과정은 아래에 적어놓았습니다. 1. RiboEx 1ml을 넣고 피펫팅을 하여 세포를 회수한 후 Chlroform 200ul씩 넣고 볼텍싱하여 4도에 15분 두기 2. 13000g , 15min centrifuge 후 상등액 200ul 만 isopropanol 500ul에 넣고 4도에 15분 두기 3. 다시 13000g, 15min centrifuge 4. 펠렛을 제외하고 나머지는 피펫으로 빨아들이고 75%에탄올을 600ul넣고 13000g, 15min centrifuge를 하여 워싱 (이 과정 3번 반복) 5. 피펫으로 나머지 알코올 최대한 제거 후 Ep tube 뚜껑 열어서 말려주기 6. 50도에 히팅한 NFDW를 6ul 정도 펠렛이 들어있는 튜브에 넣고 잘 mix하여 나노드랍찍기   control군과 물질처리한 군을 비교해 보기 위해 진행하였습니다. control군의 RNA양은 800ng/ul정도 나오는데 treat한 군의 RNA양은 80~90ng/ul정도로 너무 적게 나와서요. 260/280값과 260/230값은 모두 정상범위안에 들어왔고, treat한 군의 세포를 현미경으로 확인하였을 때는 죽어보이진 않았습니다. 10번정도 진행했는데 거의 같은 결과가 나와서 핸들링 문제는 아닌 것 같아요.. 조언 부탁드립니다ㅜㅜ
회원작성글 asgacaew  |  09.22
Q. PCR melting curve peak 관련 질문 드립니다.
안녕하세요. PCR 진행 중 primer peak 관련해서 질문 드립니다.   현재 저희가 선배 실험을 그대로 재현하는 중이어서 예전에 사용했던 primer와 같은 sequence로 제작하여 사용 중입니다.  근데 타겟군에서는 melting curve peak가 1개로 일정하게 나오는데 nc군에서는 melting curve peak가 일정하지 않고 다른 쪽에서 1 peak를 찍거나 2 peak를 찍는 경우가 있습니다. 전에 실험했던 선배는 primer 문제는 없다고 했습니다. PCR cycle은 95도 10분 preheat 후 95도 15초 -> 60도 15초 -> 72도 30초로 40 cycle 진행하였습니다. primer의 TM값은 58도입니다. NC 군의 melting curve이고 타겟군의 melting curve 입니다.   PCR을 여러번 진행했는데 매번 같은 결과가 나왔습니다. 재현 실험이라 primer 교체는 최후로 생각하고 있습니다.   답변 주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 anfakfen  |  09.22
Q. 포자 pcr
포자가 형성된 상태의 균은 pcr이 잘 되지 않는 이유가 무엇일까요?
회원작성글 새보  |  09.22
Q. PCR 에 대해 궁금한 부분이 있어 질문드립니다.
안녕하세요.  PCR 실험을 하다가 막히는 부분이 있어 질문드립니다. Auto water, E-buffer, dNTP, E-Taq, primer, DNA template 을 만들고 조건에 맞춰 PCR을 진행했고 Control을 걸기 위해 DNA template 대신 오토 DW를 넣어주었는데  (uto water, E-buffer, dNTP, E-Taq, primer, DNA template 대신 DW)   (마커, sample1, sample2, sample3, water 순서입니다.) 원하는 크기의 band가 뜨던데, 당연한건지 궁금해서 질문드립니다. 그리고 이렇게 control을 거는게 맞는건지 궁금합니다. 바쁘신데 제 글을 읽어주셔서 감사합니다.
회원작성글 실험알못  |  09.21
Q. PCR premix 만들었는데 반응이 안됩니다.
안녕하세요! 이번에 PCR을 좀 더 쉽게 돌릴 방법을 찾는다고 premix를 만들어서 사용하려고 여러 시도 중에 있습니다.   dye까지 들어간 프리믹스를 만들고 싶어서 일반적으로 전기영동을 내릴 때 쓰는 6X loading buffer를 첨가하여 premix를 만들어 PCR을 돌려보았는데요 결과적으로 증폭이 확인되지 않았습니다ㅠㅠ 6X loading buffer 말고 그냥 dye만 넣어서 만들었어야하는 걸까요? 새롭게 만든거랑 시제품이랑 섞어서 돌리면 또 잘 나오거든요... 대체 문제가 무엇일까요ㅠㅠ 혹시 dye 넣고 프리믹스 만들어보신 분 계시다면 조언 부탁드립니다!
회원작성글 조조조  |  09.21
Q. 나노드랍 측정값과 광학활성 관련해서 궁금한 점 있습니다
PCR을 하기 위해 DNA extraction 이후 나노드랍으로 순도 측정 해봤습니다   2번씩 측정했는데 평균값이 260/280 ratio : 1.85    260/230 ratio : 2.61   ng/ul : 41.285    A260=0.826 으로 나왔는데, 여기서 궁금한 점이   1. 유기용매는 A230에서 최대 absorbance를 하는 것으로 알고 있는데요. 에탄올 또한 A230에서 최대 흡수를 일으키지 않나요? 맞다면 에탄올이 A230이 아닌 A260 측정값에 영향을 줄 수 있나요?   2. 측정값을 보고 제가 내린 결론은 260에서 DNA를 제외한 260nm파장을 흡수하는 오염물질이 제거가 덜 되었고, 또한 A260값은 DNA+x(오염물질)이기 때문에 260/280 ratio의 값도 정상적으로 보이지만 A280에서 단백질이 덜 씻겨내려갔기 때문에 정상적인 값으로 측정되었다고 생각하는데 잘된 추론인지 잘못된 추론인지 궁금합니다..!
회원작성글 형준팍  |  09.20
Q. Q-PCR 프라이머와 읽고자 하는 gene의 길이에 관련하여 질문합니다.
안녕하세요 저는 q-pcr을 진행할려고 하는 학생입니다. gene에 맞는 q-pcr primer를 구글링을 통해 찾았는데, 제가 의문이 든 점은.  일단 제가 보고자 하는 gene의 길이는 약 1800bp입니다. 하지만 나와있는 q-pcr의 프라이머들은 amplicon size가 약 200bp 내외더라구요.  그러면 유전자 전체를 읽지 않고 유전자 내 200bp 정도만 q-pcr로 읽혀도 되는지 궁금합니다. 원래 이러한 방식으로 하는지요.   + 제가 구글링 해서 찾은 q-pcr primer 은 총 4쌍으로, 제가 하고자 하는 gene의 1800bp에서  증폭시키는 사이즈 부위가 다르더라구요, 여기서 어떠한 기준으로 프라이머를  골라쓰면 되는건가요?
회원작성글 룰루랄라라라  |  09.19
Q. cDNA 합성 후 qPCR 과정에서 정량 관련 질문드립니다.
안녕하세요.. 초보 석사과정 생입니다. qPCR을 여러번 진행 중에 있는데 어려움이 있어서 질문드립니다. cDNA 합성 시 nanodrop으로 total RNA를 정량하여 1ug으로 맞추고, RNA 양이 적으면 가능한 대로 맞춰서 합성하고 있습니다. 합성할 때는 모든 sample의 RNA양은 갖게 맞추고 있습니다. 문제는 RNA의 양을 맞춰서 cDNA를 합성하고 qPCR을 할 때 GAPDH의 Ct값이 sample들 사이에서 많이 다르다는 것인데요.. qPCR은 duplicate로 진행하고 있는데 qPCR 시의 문제는 아닌 것 같고, cDNA를 합성할 때의 문제인 것 같은데 nanodrop으로 확인을 하고 양을 맞추어 합성을 하는데도 이렇게 달라질 수 있는걸까요 ㅠ_ㅠ(Ct 값으로 2정도 까지 차이가 있습니다) 혹시 nanodrop에서 RNA로 정량되는 수치가 틀렸을 수 있나요? 선배님들의 답변 부탁드립니다.. 감사합니다!
회원작성글 주먹밥김  |  09.16
Q. 2차 Nested PCR 진행시 NC, PC(negative control, positive control) 샘플링
2차 Nested PCR 진행시 NC, PC(negative control, positive control)도 시료와 같이 1차 PCR 진행했던 것에서 샘플링 해야 되나요?
회원작성글 그리심  |  09.15
Q. real time pcr 띄 없음
생명과학 고수님들 안녕하세요! 저는 고등학교에 다니고있는 학생입니다.  학교에서 구강상피세포를 이용하여 ACE 유전자 타입을 알아보는 실험을 했는데 모든 조에서 DNA 밴드를 관찰할 수 없었습니다 ㅠㅠ 예상되는 이유가 몇개 있는데 1. 히팅블럭 사용의 유무 ( 학교에 히팅블럭이 없어 그냥 끓는 물에 가열했습니다. 일정한 온도로 가열할 수 없었는데 이것이 세포막 파괴에 영향을 주었을까요? ) 2. 피펫 사용 미숙으로 시료가 균일하게 섞이지 않았다. 3. Agarose gel을 만드는 과정에서 EtBr을 너무 높은 온도에서 섞으면 안된다고 알고있습니다. 이것이 사실인가요? 만약 사실이라면 이유가 무엇일까요? 또 저희는 실험 과정에서 ErBr이 아니라 생물나라의 SafeShine™ DNA Stain을 사용했는데 이 시약도 높은 온도의 Agarose와 섞으면 안되는 걸까요? 4. 실험이 예상보다 지연되어서 냉동보관이 필요한 시약들이 상온에 꽤 오랜시간(약 1시간) 방치되었습니다.    크게는 이렇게 4가지 이유가 있는데 고수님들께서 보시기에는 어떤 이유가 가장 가능성 있다고 생각하시나요? 그리고 pcr과정 말고 전기영동 자주 나오는 실수는 어떤게 있을까요?
회원작성글 생쪼  |  09.15
Q. Nested PCR 중 NC, PC 샘플링 문의
분자 진단을 이제 배우며 시작하는 단계라 부끄럽지만 문의 드립니다. Nested PCR 중 negative, positive control 도 시료와 같이 1차 PCR 진행한 것에서 샘플링 해야 되는건지 궁금합니다. 박사님께서 1차 PCR 완료된 것에서 샘플링 하여 진행하는 걸로 알려주셨는데 NC에서도 밴드가 계속 보여서 NC만 1차 PCR 진행하지 않고 2차 PCR 진행하여 확인했는데 밴드가 보이지 않습니다. 정확히 어떻게 해야 하는지 궁금합니다. 그리고 2차 PCR때 primer 농도에 따라 결과 값도 달라지던데 자세한 답변 부탁드립니다. ^^;;    
회원작성글 그리심  |  09.14
Q. PCR에서 증폭이 되지 않습니다
안녕하세요. 현재 석사 하고 있는 대학원생입니다.   제가 primer를 새로 디자인하여 PCR을 해봤는데, real time 그래프로도 그렇고 전기영동에서도 전혀 증폭이 되지 않아서 질문 드립니다.   디자인할때 Tm값을 낮게 디자인하긴 했는데, 그렇다기엔 다른 target으로 디자인한 비슷한 Tm의 primer는 증폭이 잘 되었습니다.   간혹 이런 경우가 있을 수 있나요? 찾아보아도 원인이 뭔지 잘 모르겠어서 질문 남깁니다.
회원작성글 미니썬  |  09.14
Q. primer 효율이 100% 이상이 나올 수 있나요? 첨부파일
real time pcr을 하기 전에 GAPDH primer의 효율을 먼저 측정하려고 합니다. Original DNA에서 1/10씩 serial dilution한 DNA를 준비하고(1/10000 까지) 소프트웨어에서 annealing temp.랑 melt curve 작성 등에 대한 조건을 setting하고 real time pcr을 돌렸습니다. 결과는 다음 그림과 같이 나왔는데 R^2 값도 0.997로 신빙성이 있을 것으로 생각되지만 primer 효율이 112% 정도로 나왔습니다. 써도 괜찮을 primer일까요? 100% 이상이 나오기도 하나요?    
회원작성글 YTB  |  09.08
Q. 전기영동 실험 실패 원인 첨부파일
전기영동 실험 실패 원인을 찾고있습니다. 왼쪽이 원래 나와야 할 실험결과이고, 저희 조는 오른쪽 같이 나왔습니다. 왼쪽부터 순서대로 marker, PGC5, EcoR1, Xma1+Hind3, Xho1+Pst1 입니다. 제한효소 처리가 제대로 되지 않은 것 같은데, 정확히 어떤 게 잘 안잘렸는지도 알 수 있을까요..? 그리고 교수님께서 로딩속도차이?때문에 오류가 생겼을 수도 있다고 언급하셨다는데(제가 들은 게 아니라서 확실하진 않습니다) 로딩속도차이가 결과에 영향을 줄 수도 있나요?
회원작성글 Florescenc..  |  09.07
Q. rt-pcr과 real time pcr
실험실에 takara의 카테고리 넘버가 rr410인 Real time-pcr 키트가 있는데요.  혹시 이 제품으로 reverse transcription-pcr을 진행해도 잘 진행될까요? 결과가 안 나오는 것 같아 질문 올립니다. 
회원작성글 똥글똥굴똥글  |  09.06
Q. ***PCR Negative band가 계속 뜨는데 Primer 컨탐인가요? 첨부파일
안녕하세요 매번 도움만 받고 있어서 죄송스럽지만,, 너무 애를 먹고 있어서 올리게 되었습니다.  PCR Primer가 주문한지 오래되어서 그런가 처음 사용할때부터 밴드가  위에부터 non specific하게 다 떠서 primer 혹은 DW 컨탐인지 알아보고자 실험을 진행했습니다.    저희는 PCR Premix kit를 사용하고 Total volume 20ul에 17ul DW, 5' Primer 1ul, 3' Primer 1ul, cDNA Sample 1ul 넣어서 Primer당 5pmole이 들어가게끔 해서 Cycle을 돌립니다. DNA Ladder은 1000bp입니다. 사용한 Primer는 188bp입니다. 5' tm값은 53.6도, 3' tm값은 53.4도 입니다. 프라이머 녹일때는 클린밴치에서 Rnase water로 녹입니다.    이번에 사용한 DW는 모두 새로 받아서 하나는 그대로 하나는 클린밴치에서 필터처리 해서 사용했습니다.  첨부사진보시면, (왼쪽부터 순서대로) DNA Ladder, (잘못 넣은 lane), cDNA Sample+Primer, Filter처리 DW+Primer, DW+Primer, Filter처리 DW+Primer 순으로 만들었고 95도 30sec, 55도 30sec, 72도 1min으로 PCR 35cycle 돌렸습니다. 이후 전기영동은 35min 100v로 내렸습니다.  이런경우 Primer를 다시 주문해야할 것 같은데 문제는 GAPDH의 경우에도 cDNA만 넣어서 돌릴때는 깔끔하게 원밴드만 나오다가 DW만 넣고 negative를 확인하면 저렇게 밴드가 주르륵 뜬다는 것입니다. 이 프라이머의 경우에는 DNA Template를 넣어서 돌려도 애초에 저렇게 뜹니다.  이런 경우 어떻게 해야 할까요?           
회원작성글 사고치는뚝딱이  |  09.02
Q. Housekeeping gene Ct값..
실험군과 대조군을 target gene과 housekeeping gene으로 qPCR을 했는데요 Housekeeping gene이 어떤 조건에서도 Ct값의 변화가 없고 안정적인 걸로 알고있습니다. 그런데 Ct값이 대조군에서는 22,23,22 이렇게 뜬다면 실험군에서는 24,24,25 이렇게 뜨는데.. 이렇게 실험 조건에 따라 다르게 나올 수가 있나요? 제가 잘못된 housekeeping gene을 선택한걸까요?   이렇게 뜨는게 일반적인 상황인지 아니면 잘못된 건지 궁금합니다!
회원작성글 soor  |  09.01
Q. 농도계산 고수님들 Data sheet 내용이 제가 이해한게 맞는지 모르겠습니다.
우선 데이터 시트에는  Each vial contains 3.3nmol of lyophilized siRNA, sufficient for 10uM solution once resuspended using protocol below.   Store lyophilized siRNA duplex at -20도 with desciccant.  Stable for at least one year from the date of shipment. Once resuspended, store at -20도 avoid contact with RNAses and repeated freeze thaw cycles.    Reuspend lyophilized siRNA duplex in 330ul of the RNAse-free water provided.  Resuspension of the siRNA duplex in 330ul of RNAse-free water makes a 10uM solution in a 10uM Tris-HCL, pH 8.0, 20mM NaCl, 1mM EDTA buffered solution.    RT-PCR Primer(20ul).    여기까지가 데이터 시트 내용입니다.  바이알마다 3.3nmol이 들어가있어서 330ul의 RNAse-free water를 넣으면 농도가 10uM이 된다는건가요? 이때는 ul당 10uM이게 되는건가요?    일반적으로 바이오니아에서 시키면 Volume for 100pmoles/ul =  xxxul 로 되어 있어서  xxxul만큼의 DW나 RNAse-free water를 넣어주면 100pmoles/ul이 되고  5' primer 1ul, 3' primer 1ul, sample 1ul, DW 17ul만큼 키트에 넣고 PCR을 돌립니다.  그렇게 돌리면 primer 당 5pmol로 돌리게 되는데    위의 데이터시트 바탕으로 (만약 1ul당 10uM라면) 330ul의 10uM을 5pmol로 돌리게 되면 330ul 중 0.5ul씩 넣어야 하는건가요?   
회원작성글 사고치는뚝딱이  |  08.26
Q. 안녕하세요 RealtimePCR 2^-ddct 차트 작성 중에 질문드립니다 첨부파일
이제 입학 예정인 예비대학원생입니다. 특정 물질 처리 후 group과 control group 간의 target gene 발현량을 비교하기 위해 상대 정량 PCR을 진행했습니다. https://www.youtube.com/watch?v=Kkle8T7aXjk 위 영상을 참고하여 2^-ddCt method에 따라 차트를 만들고 있는데 표준오차를 어떻게 집어넣어야 될 지 몰라서 고민입니다. 같은 treated group 간의 표준오차를 집어넣어야 하는데 이미 2^-ddCt 이전에 Ct value를 평균으로 합쳐버려서 이걸 어떻게 건드려야 될 지 모르겠네요... 고수분들의 도움 부탁드립니다. Ct value 와 2^-ddCt 가 적힌 데이터는 엑셀파일로 첨부했습니다.  
회원작성글 IGF  |  08.24
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