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BioLab 이은열 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA
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Q. 식물 primer 설계 질문 드립니다.
목표식물에서 타겟물질 생성 Pathway에 있는 유전자들의 서열과 qPCR을 이용해서 발현량을 보고 싶은데    - 현재 pathway는 reference를 찾았습니다.  - 전장유전체 분석이 ncbi 등에 있지 않은데,   타겟물질이 생성되고 pathway가 유사한 다른식물의 공동된 유전자의 primer를 가져와서 적용해보는건 괜찮은 시도인가요??    - 해당 유전자의 유사도 E-value 등을 측정할 때 같은 primer를 사용해서 하는게 보통인지 궁금하네요   다 인터넷 찾고 논문 읽으면서 공부해서 다른 사람한테 직접 배운게 없어서 모르는게 많습니다 ㅠㅠ
회원작성글 흰털누누  |  10.01
Q. Real-time PCR 실험 process를 짜봤는데 많이 이상한가요
Cell에서 RNA 추출 후 cDNA합성하여 template로 사용하려고 합니다. Housekeeping gene으로 GAPDH를 사용하고 샘플들 간의 gene A(예시) 발현량 차이를 Real time PCR로 비교하려고 합니다. 먼저 GAPDH와 gene A의 STD curve를 그려서 R^2=0.99 이상에서  Eff%가 90~110% 안으로 들어오는지 확인합니다. 그리고 Melt Curve에서 sharp하게 하나의 peak만 뜨면 일단 primer에는 문제가 없다고 보고,  샘플들 간의 gene A 발현량 비교를 위한 본 실험에 들어가려고 합니다. 교수님께서는 굳이 STD curve 그리지 말고 그냥 바로 본 실험 하라고 하시는데, primer 디자인이나 STD의 dilution factor 등 다른 요인은 빼고 위 과정 자체만 봤을 때 이상하거나 부족한 부분이 있을까요?
회원작성글 Crucial  |  09.30
Q. 돌연변이 유도 실험관련 조언 부탁드립니다
Zebrafish( Danio rerio)에 있어서 돌연변이 유도 화학물질이라고 생각되는 물질 "X"를 zebrafish에 처리해서 돌연변이를 유도시킬 계획입니다. 실험계획을 짜고있는데 돌연변이 실험 관련해서 조언을 구할 수 있는 곳이 없어 부득이하게 BRIC 고수분들께 질문올립니다.   실험계획 1. gDNA extraction by finclip (물질 "X" 처리 전) =a   2. 물질 "X" 처리, (Control group은 미처리)   3. gDNA extraction by finclip (물질 "X" 처리 후) =b   4. a, b + 선별된 target gene 1,2,3,4,5 primer + SYBR Green mix  realtimePCR->melting curve 확인   5. a, b 에서 같은 target gene의 melting curve가 달라졌다면 돌연변이 유도가 일어났다고 판단 (Control group이 달라졌을 경우 troubleshooting 후 재실험)   과정중에 어떤 부분이 미흡한지 지적 부탁드립니다. 추가적으로 더 나은 실험법이 있다면 공유부탁드립니다!
회원작성글 IGF  |  09.30
Q. Real-time PCR multiplex 실험 계획 세울때 생각해야할 것들 조언 부탁드립니다
안녕하세요.   Real-time PCR multiplex 실험을 계획할 때 생각해야할 것들에 대해 고수님들의 조언을 부탁 드립니다.   일단 primer / probe 디자인해서 multialign으로 검증해보기 (특이성 확인, primer 2차구조 형성 여부, dimer 생성 여부 등) 그 다음에 실제로 primer, probe를 주문해서 잘 working하는지 테스트를 해보는 단계에서는 어떤 점을 생각해야 할까요?   단일 primer가 잘 되는지는 일반 PCR과 전기영동으로 size 확인해볼 수 있을 것 같은데.. Multiplex 해서는 probe 테스트 전에 SYBR 방식으로 테스트 해볼 필요가 있을까요??   이쪽은 처음이라 무지해서 고수분들의 조언을 듣고싶습니다..!! 부탁드려요 ㅜㅜ
회원작성글 dyleeh  |  09.30
Q. plasmid perp 이후 SLIC을 위한 enzyme cut.. 질문입니다.
안녕하세요. 대학원 입학 준비중인 인턴연구원 입니다. 현재 SLIC cloning을 위한 insert와 vactor를 준비중에 실험 진행이 되지 않아 질문 남깁니다.. 1. vactor로 사용되는 plasmid의 경우 약 16kb정도 되는 크기이며, slf1, blp1 두개의 cut enzyme으로 cut하려 합니다. 초반에는 되는것으로 확인되어 문제가 없었는데, 어느순간부터 cut이 되지 않아 다음 스텝으로 진행하지 못하고 있습니다. 2. prep의 경우 30ul정도 elute할때 700ng/ul정도 준수하게 나오고 있어 문제가 없는것으로 생각하고 있습니다.  3. enzyme의 경우 b사의 blp1, srf1을 사용하고 buffer는 cutsmart(10x) 사용하고있습니다.  문제를 바로잡기 위해 고려해야 할 부분이 무엇이 있을까요?
회원작성글 zebra dani..  |  09.29
Q. 항균능력이 있는 박테리아의 항균능력 유전자 발현을 Real time PCR로 관찰 가능한가요
안녕하십니까  현재 일본 대학원에 재학중인 유학생입니다.  미생물 비료에 관한 연구를 진행중에 있습니다.  항균능력이 있는 비병원성 Ralstonia(길항미생물)가 병원균에 항생물질을 생산할 때 발현되는 유전자를 특정하기 위해 Real time PCR을 이용하고 싶은데, 논문 대부분에서는 표적이 되는 병원균을 PCR하는 경우밖에 없었기 때문에 질문드립니다(조사 능력 부족일 수도 있습니다만..ㅠㅠ). 항생물질을 생산하는 박테리아의 유전자 발현을 RT PCR로 분석할 수는 없을까요? 또한 관련된 논문이 있다면 알려주시면 감사드리겠습니다.    두서없는 글 읽어주셔서 감사드립니다. 
회원작성글 항균미생물  |  09.29
Q. cloning 실험 방법
안녕하세요,  전공자가 아니라서, 이리저리 찾아 보다 질문드립니다. 기초적인 것 일 수 있어, 귀찮을 수 있지만 답변 부탁드립니다 ㅠ cloning 실험을 해야하는데,  ** vector 위치 ; 5.6kb     ** insert 위치 ; 1.3kb   <cloning process> 1. insert, vector DNA plasmid 제작 (TF->miniprep 추출) 2. insert DNA PCR증폭  3. digest/CIP 4. gel extraction 5.  ligation  6. Transfromation 후 전기영동 확인     이런 순서로 진행 되는 걸로 찾아 봣는데,,  궁금한 점은, 저 과정 중에서  1. insert, vector DNA plasmid 를 TF 하여 mini prep 으로 추출 하였고,      insert; 122ng/ul , vector 93ng/ul 로 50ul 씩 뽑혀 있습니다.      이 농도로는 PCR 증폭 과정 없이 사용 할 수 있나요?     아님, 실험과정에 PCR 증폭과정을 해야 하나요?      어느 정도의 양의 DNA plasmid sample이 있어야 cloning 실험하는데      적당 할까요?           2. gel extraction gel loading 양과 DNA 농도는 얼마나 되어야 하나요?   
회원작성글 dhehfl  |  09.29
Q. q-PCR에서 정량한계 미만일 때 시스템적합성(RSD)의 처리
시험법 검증을 통해 산출한 정량한계가 5라고 가정했을때 시험을 통해 측정된 sample의 평균농도가 3(triplicate)이라면 시스템적합성(RSD)를 평가하지 않는것이 맞을까요? 정량한계 미만이지만 표준곡선내에는 sample의 농도가 들어옵니다... 정량한계 미만으로 RSD를 평가하지 않는다면 해당 근거가되는 문헌이 없을까요?    
회원작성글 내일은비  |  09.29
Q. bacteria transformation 결과 확인을 위한 pcr이후 전기영동에 관한 질문
안녕하세요 학부 실험과제를 작성하다 궁금한 점이 생겨 질문 드립니다. bacteria transformation 결과 확인을 위해 pcr이후 전기영동을 했을때 positive control과 negative control을 사용하여 비교한다고 알고 있는데요. 이때 positive control에는 제작한 재조합 plasmid를 사용해 이것과 일치하는 지를 비교하는 것이고 negative control은 잘못된 예시로 판별한다고 하는데 이때 궁금한 것이 그냥 positive control만 사용해도 transformation이 잘 되었는지 알 수 있는 것 아닌가요? 왜 negative control를 사용해야하는지 잘 이해가 안갑니다. 또한 왜 negative control를 거의 증류수로 사용하는지 궁금합니다.
회원작성글 리코타치즈샐러드  |  09.28
Q. 미지 미생물 동정 (dna sequencing 의뢰)에 앞서..
미지의 미생물을 채취하여 배양한 뒤 시퀀싱을 의뢰해서 동정하는 실험을 진행하고 싶습니다. 의뢰하려는 기업은 cosmogentech을 생각하고 있습니다.   제가 미생물을 채취한 뒤 순수분리 해서 의뢰를 드리면 시퀀스 분석을 해주시는 건가요? 분석을 맡기기에 앞서 제가 실험실에서 해야 하는 작업이 어떤 것들이 있는지 궁금합니다. PCR을 진행해야 하나요? 비용은 어느정도 되는지 궁금합니다. 감사합니다 ㅠㅠ
회원작성글 신민성의용암수  |  09.28
Q. C사의 DNA 염색 시약에 대해... 첨부파일
먼저 제조사는 명기하지 않고 C사라 하겠습니다. 제가 사용한 것은 10,000x ETBR 대응 blue light 발광 시약입니다. 퀄리티는 매우 좋게 나왔습니다. dye와 ladder를 섞어 놓고 볼륨의 양으로 loading 한 결과 사이즈 차이가 나는 것으로 확인했습니다. 여기서 일반적으로 생각할수 있는건 dye의 분자량이 영향을 줘서, 많은 양의 ladder를 loading 하면 속도가 느리고, 적은양의 ladder는 상대적으로 빠르게 이동한다라고 보는게 일반적일 것입니다. 이 데이터를 가지고 본사에 문의한결과 Dear Customer, thank you for your request. Commonly low amount of DNA showed fast run and high amount of DNA showed slow run, the same behavior is showed by the proteins. The run depends from the amount of DNA sample loaded and not from the green stain used at the same quantity for each DNA samples. DNA의 양에 따라 이동속도가 차이나는 것은 당연하다 라고 답변을 주네요... 여러분은 어떤게 맞는 것 같습니까? 1. DNA 양이 많으면 dye가 더 많이 binding 하여 이동속도에 영향을 주었다. 2. 아니다 같은 비율로 dye가 바인딩 하니 DNA의 양에 따라 이동속도에 영향을 주었다. 참고로 제조사인 C사는 결코 작은 회사는 아닙니다. 형광쪽으로 유명한 회사입니다.
회원작성글 안재진  |  09.28
Q. BIONEER BST solution 역할관련 질문드립니다.
안녕하세요? Purification 과정 중 사용하는 BST solution 관련 질문이 있어서 글을 올리게 되었습니다. BIONEER에서 PCR/GEL purification kit나 Mini-prep kit 같은 키트들에 보면 BST solution이 추가된것 같은데 이게 무슨 역할인지 궁금합니다. MSDS보면 EtOH랑 NaOH가 포함되어있고, sample을 column에 transfer하기 전에 미리 BST solution을 column에 뿌리고 센트리한 다음에 sample을 transfer합니다.  Mini-prep의 경우 Lysis buffer에 NaOH가 들어있어서 이것과 비슷한 역할 인가 했으나 Mini-prep말고 다른 여러가지 column을 사용하는 실험에는 다 BST solution 관련 언급이 되어 있어서 역할을 잘 모르겠습니다.. 알려주시면 감사하겠습니다!
회원작성글 Hms  |  09.28
Q. DNA 질문입니다
실험 문의는 아니고 DNA 복구 기작에서 궁금한점이 있습니다. DNA 복구 기작중 뉴클레오티드 절제 복구, 광분해 복구, 염기 절제 복구가 있는 것으로 알고 있습니다. 인간의 경우는 광분해 복구는 안일어나는 것으로 압니다만 세균에서는 셋 다 일어나는 것으로 압니다. 세균에서 그리고 인간에서 어떤 경우에 각각의 복구 기작이 일어나는지 궁금합니다. 예를 들어 DNA에 존재하는 유라실의 제거 복구에는 염기 절제 복구가 일어 나는 것으로 알고 있는데, 이때 뉴클레오티드 절제 복구가 일어날 수는 없는지 말입니다 그리고 뉴클레오티드 복구 기작에서도 염기 절제 복구에서도 인산 다이에스터 결합을 끊는거로 아는데 이는 공통된 특징인지요    
회원작성글 rlawhddjs4..  |  09.27
Q. PCR실험 시 dilution할 때, volume이 큰 것부터 넣는 이유는 무엇인가요?
PCR실험 시 dilution할 때, volume이 큰 시약부터 넣어야하는 이유가 궁금합니다.
회원작성글 꿀고구마맛탕  |  09.27
Q. E.coli K-12 MG1655에 사용 가능한 플라스미드 서칭..
안녕하세요,    E. coli K-12 MG1655에 돌연변이 단백질 서열을 과발현 시키는 실험을 하고 있습니다.    플라스미드에 서열을 삽입하여 inducible 한 형태로 만들어야 하는데, MG1655에 적합한 expression vector를 찾는 게 쉽지 않네요...  primer 종류, ori 종류 등을 다양하게 고려해서 찾아보았습니다만 적절한 발현 벡터를 못 찾았습니다. addgene에서 expression vector라고 소개하는 것들은 전부 다른 strain에서 사용 가능한 것 같이 보이고.. 사실 vector에 대한 설명을 읽어보아도 어떤 용도로 사용할 수 있는지, 왜 vector 내에 그러한 구성을 가지는 지에 대해 알기가 힘드네요  ㅜㅜ..  이런 실험 설계 시 플라스미드 선정/혹은 제작을 할 때, 어떤 방식으로 서칭을 하는 게 좋을 지 팁을 좀 알 수 있을까요? 
회원작성글 joceanil  |  09.26
Q. tRNA cloning 질문
cloning 할때 tRNA를 넣어준 vector map들을 몇개 보았는데요. 이론적인 tRNA의 뜻은 알겠는데 cloning에 tRNA를 넣어줬을때 무슨 역할을 해서 넣어주는지 알수있을까요?
회원작성글 겨율까지  |  09.26
Q. e.coli의 transformation
안녕하세요.   과제로 transformation에 관한 발표 주제를 받았는데요.   37도에서 키운 e.coli와 18도에서 키운  e.coli의 transformation efficiency를 비교했을 때 18도에서 키운 e.coli의 transformation efficiency가 더 높다고 합니다.   그래서 자료조사를 해봤는데 명확한 이유를 찾기가 힘들더라구요..   혹시 아시는분 있을까요?
회원작성글 아아아아아우  |  09.25
Q. soil DNA extraction이 안됩니다...
DNeasy powersoil pro kit를 사용하여 soil DNA extraction을 진행하는데 일부 sample에서 dna가 아에 extraction이 되지 않습니다. 처음 뽑는 것이 아니라 여러번 100개 넘개 뽑아 봤어서 방법에도 문제가 없습니다. 물론 용액에도 문제가 없습니다. trobleshooting도 handbook에 있는건 다 해봤구요...   농도가 나노드랍으로 찍어보니 평균 1ng/ul가 나오더라구요 이정도는 여러개 뽑아서 농축할 수도 없는 농도라서 걱정이 큽니다...   조금 중요한 연구라서 착잡한 마음에 눈물도 납니다.. 혹시 의심되는 해결방안이 있을까 싶어서 문의드립니다. 아니면 혹시 pcr을 돌려서 ngs center에 전달해도 문제가 없을까요??
회원작성글 Seoki  |  09.24
Q. NGS targeted sequence분석을 하는 기업이 있을까요?
DNA target sequence를 진행하고 싶은데 해당분석을 의뢰할 곳이 마땅치 않아 혹시 NGS sequence를 의뢰할 수 있는 곳이 있을까요?? 알려주시면 감사하겠습니다.
회원작성글 조재일  |  09.24
Q. glycerol stock 안만들었때
제목대로 깜박잊고 그냥 미니프렙해버렸어요...lysis buffer넣기 전에 생각나가지고 resuspension buffer넣은 상태에서 glycerol 1:1로 넣고 stock만들면 안되나요?
회원작성글 작은제인  |  09.23
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