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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA
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Q. house keeping gene CT 값 이상해요 도와주세요ㅜㅜ
안녕하세요  real-time PCR 실험하다가 막히는 부분이 있어 조언을 얻고자 글을 올립니다. HUVEC cell에서 RNA를 추출하여 여러 유전자에 대한 발현을 확인하고 있습니다.  다른 유전자에 대한 발현은 잘 나오고 있습니다. 그런데 house keeping gene  ACTB만 이상합니다. 실험 초반에는 house keeping gene(ACTB)의 ct값이 24-25에서 발현되다가 갑자기 27-28에서 발현되고 있습니다. -RNA 추출 시 농도와 QC에 이상없음. -4ug으로 cDNA 합성 후 real-time PCR에 2ul(400ng)으로 실험 일단 DW, SYBR green, primer를 싹 교체 후 ACTB만 real-time PCR 하였습니다. 이때는 CT값이 24에서 나오는 것을 확인하고 실험에 들어갔습니다.  그런데 다른 유전자는 이상없는데 ACTB만 27-28 심지어 30에서 나타나는 경우도 있습니다.  cDNA 문제가 있다고 하기엔 다른 유전자 CT값이 일정하게 나타나고.... 실험방법은 크게 변한게 없는데ㅜㅜ 혹시 Huvec cell passage에 따라 ACTB 유전자가 영향을 받는 것일까요??  
회원작성글 PMH  |  12.06
Q. Ribogreen assay 정확한 원리를 알고싶습니다.
Thermo의 Ribogreen assay kit를 가지고 mRNA 정량 실험을 쭉 진행중인데 원리로는 단순히 RNA에 형광이 붙어 분석이 가능하다고만 알고있습니다. Picogreen으로 하는 dsDNA는 정확한 매커니즘이랑 모든게 다 나와있는데 Ribogreen assay는 단순한 원리만 나오고 정확한 매커니즘은 아무리 서치를 해도 나오지 않아 이렇게 작성합니다. 정확한 매커니즘이 나와있는 지식이나 Reference가 있으면 알고싶습니다ㅜ
회원작성글 외계인눈깔아왱  |  12.05
Q. CRISPR Cas9 RNA seq
CRISPR Cas9 을 해서 gene editing을 하였고 exon2번 바로앞의 intron에 point mutation을 일으켜서  splicing vasient를 기대하고  RNA seq 한 결과를 가지고 varient matching을 하였는데 하나도 splicing varient가 detec이 되지 않는다고 합니다. 그런데, RNA seq할 때 3' primer를 쓰면 PCR이 무너져서 그럴 수도 있는지 discussion을 부탁드립니다.    
회원작성글 새슬  |  12.02
Q. RNA 추출할 때 층 분리가 안됩니다
RNA 추출하는 과정에서 chloroform 넣고  4도에서 원심 돌렸는데 일부 샘플에서 투명층이 분리가 안되고 하얗게 gel 처럼 굳어버리네요... 샘플은 혈액입니다.  원인과 해결방법 아시는 분 있을까요?
회원작성글 hazzy  |  11.30
Q. RNA gel electrophoresis 및 mRNA in vitro transcription 관련 질문입니다.
안녕하세요 일전에 in vitro transcription 결과에 대해 여쭈어본적이 있습니다. 답이 따로 안 올라왔었는데 추가 실험을 진행한 뒤 다시 고견을 여쭈러 왔습니다. 저는 6.5knt mRNA를 합성하게 되었고 UTP는 더 나은 translation을 위하여 N1-Methylpseudouridine-5'-Triphosphate로 교체하여 진행하였습니다. LiCl precipitation 이후 size확인을 위해 sample을 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, Bromophenol Blue 버퍼에 희석하여 70도에서 10분간 denaturation을 하여 2% agarose gel에 달렸습니다. 사진의 좌측이 결과구요 RNA ladder와 비교해봤을때 6.5knt가 대충 맞는 것 같습니다. 여러번 확인하는걸 좋아하는 터라 formaldehyde denaturing agarose gel에서도 달려보았는데 이번에는 6knt보다 아래에서 확인이 되더라구요. (사진의 가운데) 이상하게 생각해서 다르게 확인할 방법이 없나 하여 실험실에 있는 Reverse transcriptase master mix가 생각났습니다. master mix가 아니라 따로 되어있는 제품이면 oligo(dT) 만 이용하였을 텐데 oligo(dT)와 random hexamer가 섞여있는 제품이라 그냥 진행하였습니다. RNase H가 포함되어 있지 않은 제품이라 예상대로 major band는 6.5kb근처에서 나왔는데요. 제 궁금증은 왜 가장 정확하다고 생각되어지는 denaturing agarose gel에서의 결과만 다른 결과를 가르킬까요? 이후 transfection진행한 실험에서 제대로 working하는 것이 확인 되어서 중요한 상황은 아닙니다만 다음에 새로운 mRNA 합성을 하였을 때는 TBE-urea-PAGE를 진행하는 것이 가장 정확할까요? 항상 좋은 의견들 감사합니다.
회원작성글 실험은안될때가더많아  |  11.29
Q. 바이러스가 숙주가 없는 상태이면 추출하기도 전에 RNA degradation되기도 하나요??
RNA 추출을 하고 있는데 뭘 해도 안되고 DEPC treated water로 사용하는 모든 기구들을 소독을 해도 안돼서 너무 힘들어서 글 남깁니다.. 제가 stool suspension(대변 현탁액)에 있는 노로 바이러스에서 RNA 추출을 해야 하는데 계속 되지 않아서 기구 소독에 신경을 많이 썼는데요. 너무 안되니까 이제 샘플에 문제가 있지는 않을까라는 생각이 조심스럽게 듭니다. 바이러스가 생존을 하려면 숙주가 있어야 하는데 제가 받는 샘플은 어떠한 동물 세포나 조직에 배양된 바이러스가 아니라 그냥 stool suspension에 있는 바이러스이거든요. 저는 이 stool suspension을 다른 곳에서 아이스팩에 동봉된 상태로 보낸 곳에서 보낸지 3시간 만에 받아 바로 -80도에 aliquot해서 보관을 했었습니다. 하지만 제가 받은 샘플의 경우 조직이나 세포에 배양된 바이러스가 아니다 보니 바이러스가 쉽게 죽지 않을까 생각도 해봤는데 교수님께서 stool suspension에서 바이러스 상태로 RNA 추출를 추출하는 거고 RNA 자체를 받은 게 아니라 샘플에는 절대 문제가 없다고 하시는데 정말 바이러스 샘플에는 문제가 있을 가능성이 없을까요..?
회원작성글 uiouio  |  11.25
Q. NEB의 Bst 2.0과 3.0의 차이점을 알고 싶어요
안녕하세요 현재 LAMP PCR을 하고 있는데요 NEB사의 Bst 2.0 DNA Polymerase와  Bst 3.0 DNA Polymerase를 비교하여 실험해보니 2.0은 비교적 앞부분에서 증폭이 시작되는 반면 3.0은 뒷부분에서 증폭이 시작되는데요 2.0과 3.0 시약 조성에 어떤 차이가 있는 지 알 수 있을까요?  
회원작성글 무기명  |  11.25
Q. RNA 추출이 되지 않는데 제 실험에 뭐가 문제인지 봐주시면 정말 감사하겠습니다..
안녕하세요. RNA 추출 관련해서 궁금한 점이 있어 댓글남깁니다. 먼저 두서없이 긴 질문 드린 점 죄송합니다. 현재 RNA 추출을 해야하는데, RNA 추출이 실험의 처음 단계이고 이걸 넘어가야 다음 단계를 넘어갈 수 있는데 몇 번을 해봐도 절대 나오지 않는 난황을 겪고 있지만, 실험실에 RNA 추출하시는 분이 현재는 계시지 않아 도움을 요청할 곳이 없어 너무 힘들어 도움 요청해봅니다.. 제가 지금 stool suspension에서 RNA를 추출하고 있는데 몇 번을 해봐도 항상 RNA 추출이 안되더라구요.. Nanodrop 측정 결과 A260/A28은 3부근이 나오고, A260/A230은 0.19부근이 나옵니다. 또한 agarose gel로 측정했을 때도 밴드가 보이지 않습니다. agarose gel의 경우, RNA가 600bp가 넘으면 agarose gel로도 확인이 가능하다고 하여 일반 DNA agarose gel 만드는 방식으로 만들었으며, loading은 RNA(측정결과 110 ng/uL) 1uL, 6x loading dye 1uL, DEPC treated water 1uL를 섞어 loading하였습니다. Nanodrop 결과와 agarose gel 결과를 통해 RNA가 깨졌거나 아예 추출되지 않았다는 것을 알게 되었는데 실험 과정 중 어떤 부분이 문제일지 여쭙고 싶습니다. 먼저 사용하는 샘플인 stool suspension은 다른 연구실에서 받은 것으로, 10^6 pfu/mL의 농도를 가졌으며, 전처리 후 filter까지 내린 액체 상태의 샘플을 보낸 기준으로 3시간 후에 받아 바로 -80도에 aliquot하여 사용할 때마다 하나씩 꺼내서 사용합니다. 저희 연구실의 경우, DNA, protein, E. coil 등을 취급하며 공간이 넓지 않아 RNA 를 추출할 때는 클린벤치를 이용하였습니다. 먼저 실험하기 전, tip과 ep-tube, 핀셋은 auto clave로 가열멸균하여 RNA용으로 따로 만들었으며, 시약을 제외한 사용할 모든 기구들읕 70% 에탄올로 닦아준 후 클린벤치에 넣고 1시간동안 uv를 쬐어 소독을 시켜주었습니다. 그런 후 사용할 시약들은 에탄올로 소독하여 넣어준 후 실험동안에는 클린벤치를 절대 나가지 않았습니다. 또한 추출하는데 사용하는 제품은 Qiagen의 viral RNA mini kit입니다. 처음 제품을 받아서 프로토콜에 나온대로 310 ug의 carrier RNA에 AVE 버퍼(lysis용)를 310 uL를 넣어주어 냉동 시킨 후, 5.6 ug씩 aliqout한 것을 사용 전 용해시켜 AVL 버퍼 560 uL에 섞어준 후, 이 용액에서 560uL를 따 140uL의 stool suspension과 섞은 후 10분 간 반응시켜주었습니다. 그런 후 560 uL의 99% 에탄올을 섞어 볼텍싱 후 컬럼을 돌려 만든 (stool suspension+AVL+에탄올) 용액을 2번을 걸쳐 컬럼에서 걸러주었습니다. 그런 후, AW1 500 uL를 넣어 1분동안 6000rpm으로 버퍼를 걸러 주었고 다음으로는 AW2 500 uL를 넣어 13000 rpm으로 3분 간 걸러주었습니다. 마지막으로 kit에 있는 AVE 버퍼를 넣고 1분간 배양하여 용출해주었습니다. 또한 이 결과가 잘 나오지 않아 연구실에서 예전에 만들어 놓은 DEPC treated water를 용출 용액으로 사용하기도 하였습니다. 파이펫을 잡는 손은 최대한 샘플에 손을 닿지 않도록 주의하며 실험을 할 때는 꼭 마스크를 씁니다. 전반적인 제 실험과정은 이러한데 RNA 추출의 nanodrop 결과는 할 때마다 A260/280은 3부근이, A260/A230은 0.1~0.4부근이 나오는데 도대체 제 실험 과정에서 어떤 부분이 문제일까요..?
회원작성글 uiouio  |  11.18
Q. RNA-seq aligner STAR
안녕하세요 RNA-seq 분석을 진행하고 있는 대학원생입니다. 전사체 분석이 처음이고 분자 실험에 대해서는 초보라서 질문 드립니다. 실험 식물종은 콩이고, 현재 기관에 rna-seq을 맡기고 raw data를 받아 qc, trimming 후 referenece genome에 read들을 맵핑하려고 합니다. 그런데 STAR aligner를 이용하려고 하는데 referenece genome은 fasta file로 annotation genome file은 GTF file로 다운로드해서 사용하라고 하는데 ensembl에서 annotation genome의 GTF형식의 파일을 찾을 수 없고, FASTA와 GFF3 형식만 존재합니다. Tophat도 GTF 형식의 파일을 사용하라고 나와있어서 콩의 annotation genome의 GTF 파일을 어디서 찾아야하나요? phyzome에서도 찾아보려고 했지만 못찾았습니다.  도움 부탁드립니다!
회원작성글 실초인  |  11.16
Q. 안녕하세요 실험에 고통받는 대학원생입니다. 도와주세요ㅠ
안녕하세요 실험에 현재 고통받고 있는 대학원생입니다. 지금 cell에 tet on/off system을 이용해서 doxycycline을 처리중인데요.. 저희 실험실에 doxycycline을 처리해본 사람도 없고 주변에도 없어서 따로 물어볼 곳이 없어 여기에 물어봅니다. 저는 현재 DMEM(10%FBS, 1xP/S) media를 사용중인데여 따로 분주해놓은 media에 doxycycline을 바로 넣어서 cell에 처리하고 있습니다. 이렇게 하는게 맞는지 잘 모르겠네요ㅠㅠㅠ  혹시 doxycycline을 사용해보신 고수님들께서는 어떻게 처리하셨는지 궁금합니다ㅠㅠ
회원작성글 또찌가또  |  11.16
Q. realtime PCR 그래프
안녕하세요,   저는 RNA를 가지고 realtime PCR을 진행하고있습니다. 그런데, 결과가 증폭을하고 ct값도 읽히는데 그래프가 좀 쭈글쭈글하게 나오는 경향이 있습니다. 보정할 수 있는 방법이 있을까요? 기기는 quantstudio 5쓰고 있습니다.   감사합니다.
회원작성글 초코맛꿀  |  11.11
Q. siRNA knockdown
안녕하세요. 실험실에서 G-fectin을 이용하여 특정 gene을 녹다운 하고 있습니다.  lipofectamine 대신에 사용하고 있는데  24시간 동안 G-fectin과 siRNA를 처리하고 그 후에 약물을 처리하고 있습니다. 약물을 처리할려고 24시간 전에 처리했던 g-fectin이 포함된 배지를 suction하고 새로운  media로 체인지하고 약물을 처리하는데  혹시 새로운 media change 하기 전에 PBS 워싱을 꼭 해야하나요...? 
회원작성글 카스테랑  |  11.10
Q. RNA 전기영동 해석 부탁드립니다. 첨부파일
isolation of total RNA from cultured mammalian cells 실험을 진행했는데 전기영동 결과 해석 방법을 모르겠습니다. 
회원작성글 펭귄뒤적  |  11.05
Q. miRNA의 control을 찾으려면...
miRNA 의 발현을 보려고 하는데 miRNA가 잘 발현되는 positive control 조직 부위를 알고 싶습니다. 구글링이나 논문을 찾아봐도 잘나오지않는데 혹시 관련 사이트라던가 찾는 방법을 아시는 분이 계실까요? 
회원작성글 hazzy  |  11.01
Q. RNA puri 후 전기영동에서 RNA가 안보입니다 첨부파일
프로토콜대로 했는데 전기영동에서 RNA가 안보이네요 실험과정은 이렇습니다 2.5 x 105로 24well plate에 seeding한 뒤 3일 뒤에 cell pellet을 harvest 하였습니다 Q사와 A사의 Total RNA 키트를 사용하였고 모든 작업은 ice box에서 이뤄졌습니다 Lysis buffer 350ul 와 b-mercaptoethanol 3.5ul를 넣고 세포를 완전히 용해시킨 후 두번의 wash 과정을 거치고 중간 과정에서 DNase I 처리 과정이 있어서 각 컬럼마다 N사의 DNase I 를 넣어서 DNase I (RNase free) (1unit) 1ul 10x reaction buffer 10ul 3DW(nuclease free water) 89ul 총 100ul로 37도 인큐베이터에 10분간 반응시켰습니다 그 후로는 프로토콜의 wash 과정에 따랐고 RNase free water로 50ul로 elution 하였습니다 DNase 처리를 하였음에도 전기영동에서 gDNA contamination이 일어난 이유와 2개의 밴드로 나뉘어 보여야 될 RNA가 왜 안보이는지 모르겠습니다 2% agarose gel에서 실시했구요 어떻게 해야 될까요 도움 부탁드립니다
회원작성글 촉발  |  10.26
Q. siRNA electrophoresis 실험이 잘 안되네요ㅠ
안녕하세요. 저는 polymer base의 nanoparticle을 이용해 siRNA를 delivery하는 실험을 진행중인데요. 이들이 complex를 잘 형성했는지 보기위에 electrophoresis 실험을 현재 하고 있는데 결과가 너무 안나오네요. 저는 현재 Bioneer에서 negative control로 판매하는 FITC labeled siRNA를 이용하고 있으며, agarose gel은 1.5%~3% 모두 해보았습니다. buffer는 TAE buffer를 이용하고 있으며 gel dye로는 eco dye를 이용하고, gel 60ml 기준 eco dye 40ul을 사용합니다. well 하나 당 5ul의 sample을 loading하는데, siRNA는 280ng(10uM 기준 2ul)+loading buffer 2ul + DEPC 1ul을 mix하여 사용합니다. 논문을 따라서 100V에서 20~40min 내려보았는데, ladder는 보이는데 siRNA는 전혀 보이지 않아요... 무엇이 문제일까요?ㅠ 도와주세요..! ㅠㅠ
회원작성글 덜덜루밍  |  10.25
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