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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA > Purification/Isolation
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Q. Qiagen Rneasy mini kit로 RNA 추출
안녕하세요 실험에 대해서는 아예 모르는 초짜 대학원생입니다ㅠㅠ 졸업 논문을 위해 실험을 하게 됐는데, Cell에서 RNA를 추출해서 qRT-PCR을 돌려야 합니다. 현재 Qiagen RNeasy mini kit로 cell에서 rna 추출을 하고 있는데, 최소 6번은 했는데도 spectrophotometer로 흡광도 측정해봐도 아무것도 안 나와서 멘붕입니다.. 혹시 제가 하고 있는 과정 중 잘못됐거나 추가해야 될 점이 있으면 조언해주시면 감사하겠습니다ㅠㅠㅠ   *추출 전에 Buffer RLT 1 ml 당 B-ME 10 ul 첨가하고, Buffer RPE에 96-100% 에탄올 44ml 첨가했습니다*   *RNA 추출* 1. 6-well plate에 키우고 있어서 6 well plate 안 상층액 버리고, PBS로 wash했습니다. 2. RLT 350 ul 넣고 기울인채로 피펫 끝으로 긁어서 모이게 한 다음 튜브에 옮겨서 1분동안 vortexing했습니다. 후에 70% 에탄올 350 ul 넣고 피펫팅 10회 해서 섞었습니다. 3. 혼합한 700 ul를 spin column에 옮겨서 뚜껑 닫고 8500g에서 15초 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다. (그런데 이렇게 했을 때 막 위쪽에 하얗게 될 때도 있고 액체가 다 밑으로 안 내려올 때도 있습니다. Cell 양이 너무 많아서일까요ㅠ) 4. RW1 700 ul를 spin column에 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 15초 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다. 5. RPE 500 ul를 spin column에 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 15초 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다. 6. RPE 500 ul를 spin column에 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 2분 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다. 7. Spin column을 새로운 2 ml collection tube에 넣고 뚜껑닫고 10000g에서 1분 원심돌렸습니다. 8. Spin column을 새 1.5 ml 튜브에 옮기고 RNase-free water 40 ul를 spin column 막에 직접 넣었습니다. 뚜껑 닫고 8500g에서 1분 원심 돌렸습니다. 9. 8번에서 한 그대로 같은 튜브에 RNase-free water 40 ul를 spin column 막에 직접 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 1분 원심 돌렸습니다. 10. Spin column 제거하고 뚜껑 닫고 18 ul씩 4개로 나눠서 -80도씨에 보관합니다.   보관하기 전에 spectrophotometer로 아무리 재봐도 값이 안 나옵니다ㅠㅠ 너무 답답합니다.. 짚이는 것은 cell 양이 너무 많은지, 피펫팁으로 긁어오는게 너무 부족한지, vortexing을 너무 높은 속도에서 하는지, 알코올 넣고 피펫팅을 너무 조금 하는지 세게 하는지.. 이런 것들이 원인일까 싶기는 합니다ㅠ 추출은 실험대에서 하고 있고, 추출하기 전에 알콜로 소독하고, 피펫도 Rnazap? Rnase 제거하는 용액 뿌려서 닦고 피펫팁은 autoclave 돌린 것 사용하고 있습니다. 가운 입고 마스크 쓰고 말은 안하고 라텍스 장갑 끼고 rnazap 뿌려서 비빈 다음 진행하고 있습니다.   고칠 점 있으면 부디 알려주시기 바랍니다ㅠㅠㅠㅠ 감사합니다.
회원작성글 석나  |  09.25
Q. 나노드랍 이용한 RNA 측정 때 구아니딘 ITC
안녕하세요, 현재 병원성미생물로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하고, 그 cDNA를 RT-PCR 돌리는 과정을 하고 있는데요.   나노드랍 찍으면 가끔 Impurity 1 에 Guanidine ITC가 표기되고, Impurity 1 A260 및 Impurity 1 %CV 값과 그에 따른 Corrected (ng/uL)가 나옵니다.   이렇게 나오는 경우에는 RNA를 다시 추출하는게 맞을까요 아니면 그냥 보정된 Corrected 농도로 cDNA를 합성해도 별 문제가 없을까요? 그리고 Guanidine ITC가 나온다는건 washing이 덜 되었다는걸 의미하는걸까요?
회원작성글 촉새  |  09.19
Q. RT PCR Rna추출 과정에서 pellet이 보이지 않습니다..
안녕하세요. 현재 6well에 Raw cell을 seeding해 RT PCR을 진행하고 있는 학생입니다.  밑에 첨부한 사진과 같은 프로토콜로 진행하고 있는데, 세포가 많은 상태에서 진행함에도 불구하고 Rna isolation 과정에서 pellet이 거의 보이지 않으며, nano drop 260/280결과, Nucleic acid 농도도 굉장히 낮아 cDNA 합성을 진행할 수가 없는 상태입니다 ㅜㅜ.  (나노드롭 결과를 따로 정리한 파일입니다. )  rna 추출을 8번 이상 진행했는데도, 제대로 결과가 나온적은 한 번밖에 없습니다. ㅠㅠ 제가 RNA 추출 과정에서 세포를 죽이는 것 같은데, 아무리 생각해도 뭐가 문젠지 모르겠어 질문을 올리게 되었습니다.  모든 실험은 클린벤치에서 진행하고 있고, 지금까지 에탄올을 첨가할 때 조심스럽게 넣지 않았는데 그것이 문제인건지..? 아니면 트라이졸 피펫팅 과정에서 20번을 넘게 하기 때문에 세포가 죽어버리는건지 ..? 모르겠습니다 ㅠㅠ  미리 답변 감사드립니다!   
회원작성글 규규궁  |  09.18
Q. P/C/I 역할
rna 정제할때 phenol chloroform isoamyalcohol 사용하는데 이때 얘의 역할이 뭔가요..? 물보다 무거워서 핵산 침전 안되게끔 하는게 맞나요?
회원작성글 whoishe  |  09.08
Q. 저렴한 RNA extraction kit 추천 부탁드립니다.
안녕하세요. 대학원 석사과정생입니다. 실험 중에 cell에서 RNA extraction을 자주 하는데, 가격이 부담되어 기존에 사용하던 제품보다 조금 더 저렴한 제품이 있을까 해서 질문드립니다. 검색은 계속 해봤지만 종류가 워낙 다양한지라 선배님들께서 사용하시는 제품 중에 추천을 받을 수 있으면 좋을 것 같아서 질문드리게 되었습니다. 제가 기존에 사용하던 제품은 50prep에 230,000원(부가세 별도)인 제품입니다. 추천부탁드립니다. 감사합니다.
회원작성글 주먹밥김  |  09.05
Q. Trizol RNA prep
cell 에서 RNA prep 하려고 Trizol에 넣고 보관하기 위해서 5분정도 -80도에 넣었다가 샘플을 다 못넣은걸 늦게 발견해서 37도로 빠르게 해동하고 샘플 다시 넣은 다음 -80도에 넣었는데 혹시 RNA에 많이 안좋을까요? 아마 RNA가 그 시간 동안 cell 밖으로 나오진 않았을 것 같아서요
회원작성글 별헤는밥  |  09.04
Q. DNase I 처리 했는데도 RT(-) 샘플에서 Ct값이 뜹니다..
대조군과 실험군 RNA를 뽑은 후에 DNase I (Phenol/Chloroform extraction으로 inactivation 함) 처리를 하고 cDNA를 합성했습니다. 각각 RT(+)와 RT(-) 샘플을 만들어서 qPCR을 진행했는데 실험군에서는 RT(-)에서 Ct값이 안뜨고 대조군의 RT(-)에서는 Ct값이 뜨는걸 확인했습니다. (negative control인 water에서는 ct값이 안떴습니다.) 같이 DNase I 처리를 하엿는데 왜 대조군 샘플에서만 RT(-)가 뜨는 걸까요..? 아예 RNA 단계에서부터 오염되서 그런걸까요.,,.? 근데 오염됐다고 해도... DNase I처리하면서 purification이 됐다고 생각했는데...ㅠㅠ 어떻게 해야 하나요?? 고수분들 도와주세요..!
회원작성글 soor  |  08.30
Q. RNase A 처리에 대한 질문(Unit 관련??)
RNase A 계산과 처리 하는데 확신이 없어 질문 드리겠습니다. 1. 제가 만들려고 하는 RNase A 의 specific activity 50 U/mg 입니다. 1mg/ml 로 만들어진 stock이 있으니 이건 50U/ml 짜리가 되겠지요. 참조하는 논문에서 1U/ml로 처리 하는 것으로 확인하여 50배 희석하여 준비를 하였습니다.  그런데 갑자기 헷갈리는게 현재 처리하고자 하는 sample의 total voulme이 (200ul)과는 상관없이 처리 하는 건지 헷갈리내요!!(단순히 어떤 시약과 함께 RNA가 없다는 것을 한번  보기 위한 것이라서 농도 측정은 무시했습니다)   RNA 농도와 상관없이 total volme은 상관없을까요?? 2. 그리고 몇 U인지 모르는 1mg/ml RNase A 10ml이 얼려져 있는데,, 이건 사용 하면 안되겠죠? 예전 선배님이 한가득 만들어 놓으신거 같은데......   헷갈리는 질문에 답변 해주셔 미리 감사드리겠습니다.
회원작성글 결과를내는삶  |  08.26
Q. RNA 전기영동
rRNA 추출 후 전기영동을 하였는데 밴드 퀄리티가 이렇게 나오게 되었습니다. 겔 조성은 2%로 조금 높게 만들긴 했는데 Smear되서 밴드가 나왔네요. 이정도로 cDNA 합성후 PCR을 진행해도 될까요...? ㅠㅠ
회원작성글 임노코  |  08.16
Q. Elution buffer로서의 RNase-free water 역할
안녕하세요 제가 QIAGEN의 RNeasy Plus Mini Kit라고 RNA prep, RNA isolation을 위한 kit를 사용중입니다. Kit 안에 포함되어있는 여러 buffer들의 원리를 찾아보고 있었는데, 최종단계에서 elution buffer로 사용되는 RNase-free water가 어떠한 원리로 Pure RNA를 얻게 도와주는지 궁금해서 질문드립니다. 감사합니다.
회원작성글 Foxcatcher  |  08.11
Q. RNA Isolation 하고 nano drop을 찍으면 항상 농도가 적게나와요
안녕하세요! 현재 RT-PCR을 배우고 있는 학생입니다. 다름이 아니라 RNA를 추출하고, Nano drop을 찍으면 항상 Nucleic acid conc가 적게 나와서 고민입니다.. 평균적으로 50ng/ul이 나오는 것 같은데 혹시 이런 상황일 때 RNA 추출에서 주의해야할 점이 있을까요? 프로토콜 그대로 하고있다고 생각하는데 항상 이 값이 적게나와 다음 cDNA 합성 단계를 진행하지 못하고 있습니다 ㅜㅜ.. 마지막 단계에서 원심분리를 하면 펠렛이 Ep tube에 확실히 보이긴 하는데 나노드롭만 찍으면 값이 낮게 나오더라구요 Trizol에서 세포를 강하게 피펫팅 하는 과정에서 기포가 많이 생겨서 그런건지 아니면 Trizol에서 너무 오래 처리를 해서 그러는지 ㅜㅜ 혹시 조언좀 구할 수 있을까요? 
회원작성글 공공펄  |  08.09
Q. sequencing 시 data가 깨끗하게 나오지 않아요
  SARS-CoV-2의 spike protien을 Sanger sequencing을 통해 확인하고 있습니다.    one step RT-PCR kit(HyQ One step RT-PCR kit)를 이용해 cDNA 합성과 PCR까지 한번에 진행하고 있고, 전기영동 상에서 band가 뜨는 것을 확인 후sequencing을 업체에 의뢰하고 있습니다.    그런데 결과를 받아보면 여러개 sample 중 한두개씩 결과가 좋지 않네요ㅜㅜ    아래와 같이 comment를 받았습니다.    실험실에서 확인했을 때는 아래와 같이 band가 명확하게 확인되어 의뢰했는데 왜그럴까요..? (영동 사진의 4,5번이 sequencing 결과가 나오지 않았고, 나머지 sample은 sequencing 결과를 받았습니다.)      각각의 sample은 CT값을 기준으로 비슷한 정도의 것입니다.    10개 정도의 sample에서 한두개가 이렇게 튀니 속상하네요ㅜ   생각해볼 수 있는 원인이 뭐가 있을지 궁금합니다.
회원작성글 타코  |  08.04
Q. RNA 추출
석사 1년차 왕초보 실험자 입니다 ㅠㅠ 넙치 간에서 RNA 분리를 실시 하고 gDNA를 제거하는 과정후 전기영동 결과 입니다. 일단 결과는 RNA가 거의 다 분해되어 버렸다고 볼수 있는데 cDNA 합성 과정으로 넘어가면 안되고 다시 실시하는게 맞는 거겠죠...? gel 조성은 1%입니다. (첫번째 로딩은 DNA 마커로 그냥 한번 넣어본거라 무시하셔도 됩니다)
회원작성글 임노코  |  07.22
Q. DNase I treatment protocol 한번 봐주세요ㅠㅠ
실험실에서 이렇게 배워서 저는 이런 방법으로 DNase I을 처리했거든요. 근데.. 사용하는 DNase I (takara)의 protocol을 보면 제가 하는것과 protocol이 다르고, 또 저는 RNA 농도말고 volume으로 맞춰서 넣는데 이렇게 해도 되는건가요?? 위의 언급한 방식으로 DNase I을 처리하고 실험했을때 큰 문제가 없었고 DNA 분해가 되는 것 같습니다만...ㅠㅠ 틀린 protocol이라면 말씀 부탁드립니다.ㅠㅠ 
회원작성글 soor  |  07.18
Q. Trizol RNA extraction 첫 단계에서
제가 찾아본 모든 프로토콜에서 첫 단계가 Trizol을 넣어주는 거였는데 Trizol 넣기 전에 media를 버려야하는 것인가요? 배양 중인 plate에서 rna를 뽑아낼 거라서.. 매우 기본적인 질문이긴 합니다만 주변에 물어볼 사람이 없어서 질문 남깁니다..
회원작성글 초보실험학생_  |  07.07
Q. RNA Extraction 과정에서 isopropanol 처리 시 뿌옇게 변하는 이유
안녕하세요. 실험하다가 궁금한 것이 생겨 질문을 올리게 되었습니다. RNA Extraction 과정에서 Trizol 처리하고 chloroform을 처리한 뒤 RNA 상층액을 따로 뽑아내어 isopropanol 처리 시 뿌옇게 변하는 이유가 궁금합니다!
회원작성글 가오리우동  |  05.31
Q. RNA 추출 관련 문의, lysozyme 및 TE buffer 제조 문의
안녕하세요, 평소 궁금했던 점 찾아서 보곤 했는데 질문 올려봅니다.    실험의 개요는 그람음성세균에서 RNA 추출 후 mRNA를 cDNA 합성하여 RT-PCR하는 실험입니다.   현재 Qiagen RNAprotect bacteria reagent handbook을 보면서 그람음성세균의 RNA 추출실험을 준비하려고 하고, RNA 실험은 해보지 않은 초보자입니다.   1. 이 회사 제품은 RNA protect reagent를 처리하고 실험하라고 하는데, 이런 처리의 유무가 RNA 회수에 많은 영향을 미치나요? 다른 회사 제품에는 이런거 없는 kit도 있던데 궁금합니다.   2. cell lysis에 lysozyme, proteinase K incubation 하라고 되어 있는데,  이 회사는 Sigma L7651 lysozyme (>=40,000 units/mg)을 15mg/mL으로 포함한 TE(30mM Tris.Cl, 1mM EDTA, ph 8.0)  buffer 200uL에 proteinase k를 10-20uL첨가하여 sample에 처리하라고 되어 있습니다.  1)  제가 lysozyme sigma L1667(>=100,000 units/mg) 을 가지고 있는데,  이것으로 40,000 unit 되게 계산해서 첨가해서 써도 될까요? 이 제품은 다른 회사 kit를 구매할 때 어느 회사 lysozyme을 쓰면 좋다는 정보가 없어서 제가 임의로 구입했던 것입니다.   2) 위의 내용에 맞게 희석해서 쓸 수 있도록 lysozyme은 stock으로 만들어놓고 -70도씨 보관하면서 꺼내써도 괜찮나요? 그냥 TE buffer에 녹여서 적정량 aliquot 해두고 쓰면 되는지 궁금합니다.    3. TE buffer 제조 관련 1M Tris,HCl(pH8.0)과  EDTA powder(EDTA.Na2.2H2O, F.W. 372.24)를 가지고 있는데, EDTA가 시약 통 라벨에 5% 녹였을 때 pH가 4.45라고 나와있습니다. (EDTA.Na2.2H2O, F.W. 372.24)는 인터넷에 보니 아래와 같이 나와있는데, pH를 보정해가면서 녹여서 8.0까지 맞춘 stock을 만들고 TE buffer 제조해야 되나요.  "Preparation Instructions: This product is slowly soluble in water at room temperature up to 0.26 M, which is approximately 96 mg in a final volume of 1 ml. The pH of this solution will be in the range of 4 to 6. EDTA salts are more soluble in water as the pH increases: the more EDTA there is in the salt form, the higher the pH of a water solution, and therefore, the higher the room temperature solubility. This can be achieved by a gradual addition of concentrated sodium hydroxide solution to the EDTA solution."   4. RNA 실험에 쓰이는 모든 도구는 0.1% DEPC 처리 등 해서 쓰라고 되어 있던데, lysozyme 정량할 때랑 EDTA 정량할 때 쓰는 시약 스푼 같은 것도 모두 EDPC 처리-열처리해서 DEPC 제거 이런 과정들 다 거쳐야 하는지요, 그리고 만약 EDTA를 pH 보정을 한다면 이 때 pH 전극 등 접촉으로  혹시 오염가능한 RNase는 어떻게 불활성화 할 수 있을까요?    5. 현재 타사의 RNA ectraction 추출 kit로 추출 후 gDNA가 잔류되어 qiagen으로 바꿔 해보려하는데 qiagen protocol에는 보통은 별도의 DNase처리가 필요없다고 하는데, 이 보통의 범위가 어느 정도인지 잘 모르겠습니다. 옵션으로 필요할 경우  RNeasy mini kit 사용시 RNase free DNase 처리를 washing 단계 전에 할 수 있다고 안내하는데, 그람음성세균의 RNA 추출시 DNase 처리 안해도 gDNA 잔류없이 잘 되었는지 어땠는지 아시는 분 있을까요?    자료를 찾아봐가며 준비하고 있기는 한데 하나부터 열까지 모르는 분야 실험이라 조언 부탁드립니다. 
회원작성글 quirie-oh  |  05.31
Q. Transformation시 사용되는 e.coil strain
Transformation시 사용되는 e.coil strain이 뭐가 있는지 궁금합니다
회원작성글 개꿀빵  |  05.27
Q. plate 채로 얼린 cell를 rna extraction 하려고하는데
plate 채로 얼린 cell을 rna extraction하려고 하는데   얼려진 cell을 어떤식으로 녹이고 긁어내야하는지 모르겟습니다..
회원작성글 대애학원생  |  05.27
Q. RNase free 팁은 구매말고는 방법이 없는건가요...
저희 실험실은 신생랩인데 10년전에 구입한 것으로 추정되는 창고에 남아있던 피펫팁을 사용합니다.   RNase free 팁, RNase free water 가 RNA work에서 필요하다고 하더라구요   1.봉투하나 클린벤치 안에서 뜯어서 조심히 팁렉 안에 넣고 오토클레이브 돌리는 걸로는.... 너무 오래된 팁이라..안되겠죠??(열로 RNase를 파괴할 수 있다거나..) 2.kit 써서 RNA 추출할건데 RNase free water는 RNA 디프리저에 저장할 때 사용하는건가요??    3.RNA 저장할 때도.. RNase free micro tube가 따로 있는건가요??
회원작성글 Seoki  |  05.16
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