qPCR 결과에서 지속적으로 컨트롤군이 낮게 나타납니다..사진 첨부했습니다 실험실에 나노드롭이 없다보니 정량을 하지 못하고 그냥 실험 들어가라고 하더군요.. (박사님도 나노드롬 없는게 이해 안되는 눈치신데 교수님과 랩장님은 주문한지 오래됬는데 아직 배송이 안되서 그렇다고 하십니다.) 어쩔때는 결과 그래프가 예쁘게 나오는데 10번 중 8번은 이렇게 나타납니다ㅎ; 이렇게 나타난 이유가 RNA 농도 차이가 나서 그런걸까요? 정량을 할 수가 없으니 어떻게 해야할 지 모르겠습니다. 그리고 RNA prep후에 건조하는데 건조가 끝난 시점에서 튜브 내에 분홍색 액체가 들어있었는데 페놀 성분이 섞여들어온건가요? 이게 문제라면 순도가 낮아져도 이런 그래프가 나타날 수 있나요?

현재 석사 3개월차 대학원생입니다! 지금 hPDL cell을 분화시킨 후, RT-PCR을 진행 중에 있습니다. 지난 5월 4일에 분화media로 교체 후, 시료처리를 진행했고, 총 4일이 지난 오늘 RNA prep.을 진행했습니다. 그러나, RNA양이 적은지 pellet이 보이지 않았습니다... 과정은 Trizol 용액으로 세포 분해 chloroform 넣고 vortexing, 상온 5분 대기, centrifuge 이후 상층액 채취  상층액 부피와 1:1비율로 Isopropanol을 넣고 (400uL) 다시 centrifuge (12,000 rpm, 25min, 4c) 70% EtOH in DEPC 500uL를 넣고 다시 centrifuge(같은 조건, 5min)  건조 isopropanol을 넣고 원심분리한 직후에는 거의 보이지 않아 isopropanol 일부를 남기고 70% EtOH을 넣고 다시 centrifuge 진행했지만, 여전히 보이지 않았습니다. 그래서 한 20~50uL정도 남기고 건조하기 시작했는데, 9시간이 지난 지금도 건조되지 않고 있습니다...! clean bench에 바람나오는 부분에 뚜껑을 열고 건조하고 있는데, 평소라면 점심 먹고 와서 바로 cDNA 만들 수 있을 정도로 건조되어 있었는데, 오늘은 건조되지 않네요ㅜㅜ 한 3시부터 내부 액체크기가 변동이 없습니다; 구글에 몇시간동안 검색했지만, 저랑 같은 상황은 존재하지 않았습니다.. 제가 생각한 원인은 RNA 양에 비해 EtOH 양이 많았기 때문이라고 생각하는데, EtOH인데 9시간이 지나도 증발 안하는 것은 이상합니다..  혹시 몰라서 다시 세포를 seeding 했습니다(15일까지 결과 없으면 혼나요ㅜ). RNA 수가 적은것도 문제가 될 것 같아 이전(2 X 10^3 cell/well)과 달리 이번에는 5 X 10^3 cell/well로 시딩했습니다. 일단 clean bench안에 넣어두고 퇴근할 예정인데, 만약 내일 건조되어 있더라도 sample 사용이 가능할까요..? 그냥 얼른 새로 시료처리해서 하는게 좋을까요?  

아직 qpcr조건을 잡는중에 house keeping gene의 ct값이 너무 높게 나와서 이것저것(cDNA량, primer sequrence, pcr 시간...) 바꾸어 가면서 실험 중인데 이번에는 primer를 바꾸었더니...b-actin의 ct값이 22정도에서 26으로 나왔네요. 그래서 이것저것 비교하고 있는데, pcr 조건은 같은데 melt peak가 이렇게  곡선형 peak가 아니고, 각이진 형태의 2개의 peak이 나왔는데... pcr이 재대로 된게 아닌걸까요???ㅠㅠ  

파란색은 down-regulated, 빨간색은 up-regulated인 것으로 알고 있는데 폐의 macrophage에 LPS를 처리했을 때 ferroptosis 관련 gene들, itaconate+LPS를 같이 처리했을 때를 보았는데 제가 알고 있는 것과 달라 질문 올려봅니다 LPS를 처리했을 때 ferroptosis 관련 genes이 up-regulated되는 걸로 알고 있는데 반대로 되어있어 이해가 되지 않습니다... 그리고 LPS+ITA를 처리했을 때(itaconate를 처리했을 때 ferroptosis가 억제됩니다) 반대로 up-regulated가 되어 있어 의문점이 마구 드는 중입니다 해석 도와주시면 감사하겠습니다 논문은 https://www.nature.com/articles/s41420-021-00807-3 입니다

안녕하세요, 이번에 2*10^5개 정도의 cell sample을 trizol reagent-클로로포름을 이용해서 RNA추출을 하였습니다. 나노드랍 결과값은 아래와 같습니다. (같은 조건으로 추출을 두 번 실행했는데도 A230값이 잘 안나옵니다..) A230: 0.351 A260: 0.216 concentration: 239.0 260/280: 1.763 260/230: 0.3090 프로토콜은 invitrogen사의 메뉴얼을 그대로 따랐고, 수성층을 정말 조금...따서 진행했는데도 230 nm에서 흡광도 값이 0.351 정도가 나옵니다..ㅜㅜ 마지막 pellet air dry 시간을 8분 정도 했는데.., 에탄올이 충분히 날아가지 않은 것일까요? 메뉴얼에는 10분 이상 dry 하지 않는 걸 권장해서 적정 범위 동안 dry를 했는데... 고수님들의 의견이 궁금합니다.

안녕하세요. 단위환산에 질문이 있어서 글을 올리게 되었습니다. 1pmol/ul = 1uM으로 알고 있는데요. 제가 농도 point를 0.5nmol로 설정을 하고 1mM Stock 물질을 PBS 200ul에 0.5nmol이 되게 넣으려고 할때 0.5nmol을 uM로 단위 환산하려면 어떻게 해야 하는지 잘 몰라서 질문을 드립니다. 0.5nmol을 working으로 해서 stocking 1mM 에서 희석을 하여 Total 부피 200ul (0.2ml)을 만들려고 하거든요. 0.5nmol (uM로 단위환산) / 1mM * 0.2ml = 200ul PBS에 0.5nmol이 되게 하려면 넣어야 하는 1mM의 양 단위환산이 아직 서툴러서 답변 주시면 참고하겠습니다. 감사합니다.

안녕하세요 실험을 처음해보는 학생입니다. muscle specimen  이 있고 거기에서 rna 뽑아서 cDNA 중에 splicing 이 일어난 여부를 봐야하는 실험을 해야하는데요.   몇개의 sample은 이미 RNA-Seq data  가 있다고 하시고, fibroblast myoblast 도 있다고 몇개는 이미 저장된거 찾아보라고 사수가 얘기해주셨는데,    1. RNA-seq data 가 있다면 해당 specimend은 이미 mRNA extract은 되어있다는 의미가 맞지요? 2. fibroblast, myoblast cell이 있다는것은 각각 무엇을 의미하는지 도와주실수 있으실지요 ? 부탁드립니다.   감사합니다.

LPS와 sample 처리시 LPS 독성 때문에 iNOS 발현이 증가될 수도 있나요 ???? 농도별로 처리시 억제가 되야 하는데 계속 실험을 다시하는데 농도가 높을수록 증가하네요 ..

melt curve는 제대로 뜨는 거 같은데 amplification plot이 제대로 잡히지 않아 CT 값도 제대로 뜨지 않네요 ㅜ  이런 경우 어떤 해결방법이 있을까요 ?   

amplification plot이 자꾸 이렇게 뜨네요 ㅠ 무슨 문제가 있을까요 ?   cDNA합성도 제대로 된거 같고 문제가 없어보이는데 자꾸 plot이 안잡혀요 ㅠ 

멜팅 커브는 뜨는데 ct값이나 amplification plot이 전혀 보이지 않아요    2x pcr master mix 10 ul  cdna sample (합성 후 10배희석) 2 ul  primer (R와 F를 1:10으로 희석한 후 master mix를 만들어서 사용) 1 ul  dw 7 ul  이렇게 했는데 결과가 몇 주째 나오지 않네요 ..   

안녕하세요  유산균에 대한 qRT-PCR 수행하고자 유사 논문에서 primer를 찾았습니다. 그러나 찾은 논문의 유산균 종과 제가 확인하고자 하는 유산균(여러개라서 직접 PCR 진행하여 확인하는 것은 어렵습니다)의 속은 같으나 종이 달라 primer 증폭이 가능한지 확인하고 싶습니다. 확인할 수 있는 프로그램이나 방법이 있을까요?   이런부분 잘 아시는분 있으면 답변 부탁드립니다!!

안녕하세요~ 항상 정말 큰 도움 주셔서 감사드립니다. A라는 protein이 B라는 유전자의 프로모터에 결합해서 transcription을 조절하는지 여부를 조사하기 위해 luciferase assay를 계획하고 있습니다.   B의 프로모터에 해당하는 genomic DNA 서열에서 protein A가 결합할 수 있을 법한 binding site를 몇 군데 찾았는데요, 그 중 한 곳이 B의 mRNA 서열 안에 존재합니다. mRNA 서열이 시작하고 약 100bp 정도 downstream에 존재하는데요, 이곳도 promoter로서 기능할 수 있나요? 아니면 그냥 배제해야할 지.. 고견을 부탁드립니다. 감사합니다!

안녕하세요 항상 도움 주셔서 감사드립니다. 요즘 RT-qPCR 실험을 계속 수행하고 있습니다. mammalian cell에서 RNA를 추출한 후, oligo dT primer 사용하여 cDNA로 합성하구요 (약 800ng/μL의 농도로 20μL 얻음) 그렇게 얻은 cDNA를 template으로 qPCR 수행합니다. (튜브당 0.5μg 사용) 그런데,, qPCR 장비에 문제가 생겨서 여러 번 샘플을 날렸습니다ㅠ   중요한 샘플인데 얼마 남지 않아서,, 혹시 이걸 template으로 다시 cDNA를 합성해도 타당할지 궁금해졌습니다.   현재 남아있는 cDNA 안에는 Gapdh 도 있고 기타 여러 interested gene들의 cDNA가 일정 비율로 혼재되어있을텐데요 이걸 template으로 다시 cDNA로 합성하면, 그 안에 있던 여러 종류의 cDNA들이 거의 동일한 비율로 증폭되지 않을까요??   Cell 다시 키워서 RNA 다시 뽑으면 되긴 하는데,, 귀찮음 보다는 material 을 아끼기 위함이 큽니다 ㅠ.. cell culture 할 때 사용하는 cytokine이 많이 고가여서요..   조언 부탁드립니다. 미리 감사드립니다!!

안녕하세요. thermofisher 사에서 제공하는 oligoperfect라는 웹사이트에서 qPCR 용 primer를 디자인하고 있습니다.   아래 그림과 같이 hairpin (℃) 가 나오는데요, 해당 온도 '이하'에서 primer가 스스로 hairpin structure를 형성할 수 있다는 의미인가요? 그렇다면 hairpin temperature가 낮을수록 실험상에서 hairpin structure가 생성될 가능성이 낮다고 보아도 되는지요? 제가 제대로 이해하고 있는 것인지 궁금합니다. 감사합니다!

  안녕하세요. 석사생 입니다.. 저희 연구실에 선배가 없어서 프로토콜 뒤져가면서 검색해가면서 공부하고 있습니다. 정말 간절히 선배님들의 지혜를 구합니다.  1. 희석배율을 100배 하라고 프로토콜에 적혀있어서 100배를 했는데 이걸 왜 하는지 궁금합니다. 참고로 저는 100배가 안돼서 2배를 나눴습니다..  2. tissue에서 rna를 뽑아서 측정했는데 260/280 값은 괜찮은데 260/230 값은 1.4-1.6 범위가 아닙니다 이럴 경우에 샘플을 다시 만들어야 할까요? 아니면 그대로 pcr 돌려도 될까요? 3. ng/nl 값이 적은데 이럴경우에는 pcr 돌릴때 어떤 부분을 컨트롤 하면 좋을지 궁금합니다.    제가 pcr 초보라서 잘 모르는데 혹시 빼놓은 정보 있으면 더 올리겠습니다.