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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
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Q. 안녕하세요 실험에 고통받는 대학원생입니다. 도와주세요ㅠ
안녕하세요 실험에 현재 고통받고 있는 대학원생입니다. 지금 cell에 tet on/off system을 이용해서 doxycycline을 처리중인데요.. 저희 실험실에 doxycycline을 처리해본 사람도 없고 주변에도 없어서 따로 물어볼 곳이 없어 여기에 물어봅니다. 저는 현재 DMEM(10%FBS, 1xP/S) media를 사용중인데여 따로 분주해놓은 media에 doxycycline을 바로 넣어서 cell에 처리하고 있습니다. 이렇게 하는게 맞는지 잘 모르겠네요ㅠㅠㅠ  혹시 doxycycline을 사용해보신 고수님들께서는 어떻게 처리하셨는지 궁금합니다ㅠㅠ
회원작성글 또찌가또  |  11.16
Q. realtime PCR 그래프
안녕하세요,   저는 RNA를 가지고 realtime PCR을 진행하고있습니다. 그런데, 결과가 증폭을하고 ct값도 읽히는데 그래프가 좀 쭈글쭈글하게 나오는 경향이 있습니다. 보정할 수 있는 방법이 있을까요? 기기는 quantstudio 5쓰고 있습니다.   감사합니다.
회원작성글 초코맛꿀  |  11.11
Q. Nanodrop mRNA ratio 값 관련 질문
Nanodrop 장비(마이크로디지탈 NABI) 구매 후 처음 사용하는데 260/280 ratio가 2.0~2.2 까지 나옵니다. plate take 3 사용했을 때는 1.6~1.8 나왔습니다. 같은 sample 사용했구요. 혹시 문제가 무엇일까요??선생님들 도와주세요ㅠㅠㅠ
회원작성글 뉴트리아  |  10.25
Q. complementary sequence 확인
T7을 가지고 transcription을 진행했는데 원하는 rna크기보다 좀 더 위에 큰 밴드하나가 더 나왔습니다. 그래서 templete sequence에 complementary한 부분이 있는지 확인해 보고 싶은데 하나하나 찾는 노가다 방법 밖에 없나요? 사용 가능한 Tool이나 다른 방법이 없을까요?
회원작성글 제is  |  10.18
Q. bio-informatics관련 질문입니다.!!
안녕하세요! 박사과정 중인 학생입니다.   저는 휴먼 프라이머리셀에 단일 화합물질을 처리하여 무처리구와, 화합물질 처리구를 RNA 시퀀싱을 의뢰하여 DEG분석을 하였습니다.   이 과정중 궁금한게 있어서 질문 요청했습니다. 1. DEG로 나타나는 유전자로 기전 (mechanism)을 그릴 수 있을까요? 2. 궁극적으로 DEG로써 결론을 어떻게 내는 것이 최고의 답일까요? ex) fold change 값이 가장 큰 DEG를 선발하여 이 gene의 발현량이 가장 크게 차이났다. 라는 것으로 마무리 짓는건 너무 약해보여서요. 이제 공부 시작한 분야이기도 하고 능숙하지 않다보니, 전문가님들의  고견이 궁금합니다.   감사합니다.    
회원작성글 얗후  |  10.07
Q. heatmap 그래프 보는방법을 모르겠습니다
rna-seq 하고 heatmap을 그렸는데 heatmap 그래프 읽는 법을 모르겠습니다!ㅜㅜ 빨간건 뭐고 파란건 뭔지 알려주실분 ㅜㅜ?
회원작성글 브라더소  |  10.04
Q. RNA-seq 관련해서 질문드립니다.
RNA-seq 관련해서 셋팅을 진행하고 있는 대학원생입니다. Kallisto와 STAR를 이용해서 진행하고 있습니다.   1. Alignment tool별로 데이터가 유효한지 확인하기 위해서, Alignment tool 중에서 Kallisto와 STAR 를 둘 다 비교했는데요, FDR < 0.05 값들 중에서 많은 수의 DEG가 어느정도 유효함을 확인했습니다. 하지만 alignment 를 무얼로 했느냐에 따라서 FDR < 0.05 gene 들을 비교해볼 때, 대부분의 유전자에 대해서 LFC = -1.4 다른 한쪽은 -1.2 이런식의 섬세한 값차이가 있고, 몇몇 소수의 gene들은 LFC = -5.6, Fold change = -1.4 이런 큰 차이가 있습니다. STAR alignment시에 option이 너무 많아서 STAR를 잘못쓰는게 아닌지 하는 의심도 드는데요, 물론 method가 다르기 때문에, 다르게 나올 수 밖에 없다고 생각하는데, 이러한 섬세한 값 차이, 혹은 몇몇 소수의 큰 Variation 차이는 넘어가도 괜찮은지요? 당연히 발생하는 일인지요?     2. 일부 유전자에 대해서는 검증용 qPCR 을 진행했는데요, 저희 연구실에서 reference gene을 여러개 사용하는데, 검증용으로 qPCR 데이터를 보여줄때, RNA-seq상에서 유의미하게 FC 차이가 안나는 reference gene을 고의로 선정해서 검증해도 괜찮은지 궁금합니다. reference gene들을 RNA-seq상에서 확인해봤을 때, control vs experiment 에 따라서 RNA-seq 상에서 -0.6~06 log2FC 가 왔다갔다하는데, 만약 qPCR로 검증한 데이터를 publish한다면, 어떤 유전자로 정량한 값을 보여줘야하는지요?   고견 주시면 감사드리겠습니다.   감사합니다.    
회원작성글 신입입니다  |  09.28
Q. RNA추출 후 전기영동 밴드 첨부파일
안녕하세요. 발효식품(세균, 진균 모두 존재) 에서 RNA를 Trizol을 이용해 추출하였습니다. 전기영동(0.7% agarose, 135V, 20V)한 결과 밴드가 엄청 많이 나왔는데요,,, 첫번째 100bp ladder, 마지막이 1kb ladder이며 중간에 5개가 시료입니다. 밴드가 왜 이렇게 많으며, 각각 어떤 것인지 알 수 있을까요??
회원작성글 룰루야  |  09.20
Q. polysome profiling에서 x축이 궁금합니다.
안녕하세요, 논문을 보던 중 질문이 있어 글을 올리게 되었습니다. rna 번역에 대한 polysome profiling관련 아래와 같은 그래프를 보게 되었습니다. 제가 그동안 보았던 그래프들은 모두 x축이 sucrose gradient였고, 이는 원심분리와 관련된 것이라고 알고 있는데요.. 아래와 같이 fraction number라고 적힌 부분은 어떤 의미인가요? 너무 기초적인 질문이지만 답변해주시면 감사하겠습니다.  
회원작성글 lkdjf  |  09.17
Q. rna seq중 트리밍한 데이터를 ncbi에 올려도될까요?
저널에 투고중에 ncbi에 어세션 넘버를 넣으라고 해서 제 로우 데이터를 확인했더니 한샘플이 포워드 시퀀스 데이터가 없더라구요 ㅜㅜㅜ 트리밍한 데이터는 다있는데 이럴경우 트리밍한 데이터로 SRA에 등록해도 될까요...?
회원작성글 오오오오복  |  08.29
Q. qPCR결과와 RNA in situ 결과가 달라요..
안녕하세요. 저는 석사 과정 1학기 차 학생입니다. 저는 qPCR과 RNA in situ를 통해 mRNA level을 확인 중인데요, 둘의 결과가 다르게 나와 혼돈스러운 상태입니다. qPCR을 하기 위해 RNA extration 과정에서 실수가 있나 싶어 2번이나 새로 뽑아보고, primer도 sequence를 달리하여 여러 primer을 사용해보았는데도 RNA in situ 와 결과가 다릅니다 ㅠ  in situ probe의 양도 희석을 다양하게 하여 진행해보았지만 여전히 둘의 경향이 너무 달라 혼란스럽습니다.. 이러한 경험을 하신 분이 계실까요? 계시다면 조언 부탁드립니다!!ㅠㅠ 감사합니다~
회원작성글 도오비  |  07.26
Q. cDNA 합성과정에서 RNA 농도비에 대한 질문입니다!
cDNA 합성 과정에서 RNA 순도 측정시  260 nm/280 nm ratio는 1.8~2.0, 260 nm/230 nm ratio는 2.0~2.2이 적당한것으로 알고있는데 저는 RNA 순도 측정시 두 비율 다 2.0~2.3 정도의 값이 나옵니다. 260/230 ratio는 적당한것 같은데 260/280 ratio는 2.0을 넘어도 괜찮은 값일까요?  비율이 낮으면 오염인것으로 알고있는데 더 높아져도 오염일까요??
회원작성글 jineee  |  07.19
Q. cDNA로 pcr진행하기전에 왜-70℃로 boliling해주나요?
안녕하세요 선배님들 cDNA합성이 제목과같이 왜저렇게 보일링해주는이유가궁금합니다 ㅠㅠㅠㅠ 
회원작성글 choheec  |  07.18
Q. RT-PCR) 특정 primer에서만 smearing 현상
안녕하세요! RT-PCR 진행중에 있습니다. RNA 순도 2.0으로 잘 뽑았구요 housekeeping gene도 one-band 확인했습니다. 다른 프라이머에 대한 밴드도 예쁘게 잘 뜨고 있는데 유독 하나의 프라이머에서만 끌림 현상이 보이고 있습니다. D.W 갈고 새로 만들어서 써보고도 있는데 완전히 잡히지 않습니다. template 문제이거나 PCR 시약 문제라 생각하기에도 다른 프라이머에서 잘 나오고 있고, 다른 실험자한테는 깔끔하게 나오고 있습니다. 결국 제 손의 문제인가 싶다가도 그 프라이머만 유독 그러니 혼란스럽네요... 혹시 제가 놓친 무언가가 있을까요? 주의점이라던지..부탁드리겠습니다! 감사합니다.  
회원작성글 뽀작  |  07.15
Q. CRISPR Cas9 haplotype cDNA PCR
human APC유전자를 CRISPR Cas9을 하여  haplotype의 gene editing clone을 얻었습니다. 이렇게 했을 때, exon2가 skipping 될 것이라는 예측을 기반으로 RNA에서 cDNA를 만들어 target seq PCR하여 sanger를 돌렸는데 control과 차이가 나지 않습니다. skipping이 안된 것일까요? 아니면 haplo로 되어서 minor peak이 묻힌걸까요? 이런 경우 어떤식으로 splicing varient를 확인할 수 있을까요?
회원작성글 새슬  |  07.14
Q. shRNA
shRNA cloning 된 것을 주문해서 받아서 cell에 Transfection을 하였어요. qPCR을 돌려서 control하고 비교했을 때에, 발현이 줄지 않고 약간 과발현 된 듯이 나와서요.  PCR하는 primer를 새로 짜야하나 확인하면서, shRNA 서열 위치를 확인했어요.   coding sequence (CDS) 뒷부분에 shRNA 서열이 짜여져 있더라구요. 나름 TATA box를 포함하는데, 앞 부분이 조절하는 부분으로 배웠던 것 같아서;; 뒷 부분에 서열로 인식해서 조절하는지 궁금해요.     
회원작성글 clickclick  |  07.14
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