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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
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Q. mRna extraction에 대한 질문
S.aureus를 이용한 실험을 진행하고 있는 대학원생입니다. 새로운 실험을 계획하고 있는 중인데 Protein analysis와 mRNA analysis 중에서 어떤 부분이 더 좋을지에 대해 고민을 하고 있습니다. Protein analysis를 통해 확인하는 것으로 진행하는게 좋다고 생각하지만, micro 수준이 아닌 nano concentration이라면 Protein analysis는 어려울 수도 있다고 생각되어 대안으로 생각 중입니다. 실험 조건은 실험동물에게 infection을 시킨 후 일정 시간이 지난 후의 bacteria를 isolation 하여 즉시 mRNA analysis를 진행하게되면 in vivo 환경에서 벗어나게 되고, 이 과정에서 mRNA extraction 과정에서 gene expression rate의 변화가 발생할 것으로 생각됩니다. 주변 환경 변화에 빠르게 반응하는 gene이라면 실험에 차질이 있을 수도 있다고 생각되는데 이를 제어할 수 있는 방법이 있는지, 혹은, 무시해도 될 정도의 변화인지 궁금합니다.
회원작성글 jsun2809  |  01.16
Q. Control group에 없는 유전자 발현시 RT-qPCR ddCT값을 계산할 수 있나요 ??
 새해복 많이받으십시요 선생님들.   어떤 cell line에 해당 cell line은 발현하지 않는 외부 유전자 (ex. 바이러스의 병원성 유전자)를 발현시키는 벡터를 transfection한 경우 해당 외부 유전자의 발현양을 2^-ddCT 값으로 계산할 수가 있나요???   Control group에서는 target에 대한 qPCR ct값이 찍히지 않기 때문에 계산이 안될 것 같은데... 혹시 이런경우 정량하는 방법이 따로 있는지요 ??   읽어주셔서 감사합니다. 
회원작성글 Anchovy  |  01.03
Q. 조직 RNA 분해 시기
동물 희생 후 조직 채취한 후 부터 RNA 분해가 빠르게 진행되는 것으로 알고있는데 수치적으로 RNA 분해가 어떻게 진행되는지 알고계시는 분 계실까요?
회원작성글 나나콘  |  01.02
Q. dexamethasone 처리
안녕하세요. 근육세포로 근위축 실험을 하는 대학원생입니다. dexamethasone으로 근위축 유도를 하고 있습니다. qpcr 결과를 보면 normal과 dexmethasone을 treat 한 경우를 비교해보았을때,  근분화인자인 myogenine을 측정해보면 dexamethasone을 treat한 경우가 항상 높게 나옵니다. 몇번을 찍어봐도 이렇게 측정이 되는데. 이런 경우로 나온 적이 있으셨던분이 계신지. 정말 궁금합니다.. 도움 주세요 급합니다ㅠㅠ  
회원작성글 똑똑해지자  |  2022.12.15
Q. qPCR
안녕하세요. qPCR 연이은 실험 실패로 의욕상실에 빠져있는 학생입니다. 현재 cell로 얻은 샘플로 qPCR을 하는 중입니다. 제가 궁금한 점은  1. 경향이 반대인 결과가 자꾸 나옵니다. primer의 문제라고 생각을 해서 여러개를 주문한 상태인데, primer을 선택할때는 어떻게 하나요? 2. 똑같은 약물을 treat한 샘플(n=2)에서 qPCR 값의 너무 값의 차이가 큽니다. 손의 문제라 생각이 들어 최대한 정확하게 오차없이 진행하려 노력했구요. 이유가 궁금합니다. 해결하고 싶습니다 정말  
회원작성글 똑똑해지자  |  2022.12.15
Q. Apotosis 관련해서 RT-PCR과, Western blot 관련해서 질문이 있습니다.
안녕하세요. 저는 세포 실험 관련해서 전공자가 아닌데 실험을 진행하게 됐는데 특정 단백질이나 mRNA 발현량에서 이론처럼 증가하거나 나오지가 않아서 지금 여러번 재실험을 하고 있습니다 ㅜㅜ   제가 궁금한 점은 1) Western blot에서 cleaved-caspase3가 안 보이는데 인터넷을 찾아보니 dead cell에서 apoptosis 관련 인자들이 나오니까 dead cell까지 같이 확인하라는 얘기가 있던데 dead cell까지 같이 harvest를 해서 진행해도 되는지랑.. 2) Dead cell까지 같이 harvest를 해서 b-actin을 확인하면 Control이랑 비교했을 때, b-actin의 양 차이는 없을까요..?   3) RT-PCR을 돌리고 있는데 Dead cell에서도 mRNA 발현량이 나오는지랑, housekeeping gene이 control 대비해서 차이가 나지 않을까라는 생각에 궁금해서 여쭤봅니다.. 
회원작성글 열심히는하고싶은  |  2022.12.12
Q. house keeping gene CT 값 이상해요 도와주세요ㅜㅜ
안녕하세요  real-time PCR 실험하다가 막히는 부분이 있어 조언을 얻고자 글을 올립니다. HUVEC cell에서 RNA를 추출하여 여러 유전자에 대한 발현을 확인하고 있습니다.  다른 유전자에 대한 발현은 잘 나오고 있습니다. 그런데 house keeping gene  ACTB만 이상합니다. 실험 초반에는 house keeping gene(ACTB)의 ct값이 24-25에서 발현되다가 갑자기 27-28에서 발현되고 있습니다. -RNA 추출 시 농도와 QC에 이상없음. -4ug으로 cDNA 합성 후 real-time PCR에 2ul(400ng)으로 실험 일단 DW, SYBR green, primer를 싹 교체 후 ACTB만 real-time PCR 하였습니다. 이때는 CT값이 24에서 나오는 것을 확인하고 실험에 들어갔습니다.  그런데 다른 유전자는 이상없는데 ACTB만 27-28 심지어 30에서 나타나는 경우도 있습니다.  cDNA 문제가 있다고 하기엔 다른 유전자 CT값이 일정하게 나타나고.... 실험방법은 크게 변한게 없는데ㅜㅜ 혹시 Huvec cell passage에 따라 ACTB 유전자가 영향을 받는 것일까요??  
회원작성글 PMH  |  2022.12.06
Q. Ribogreen assay 정확한 원리를 알고싶습니다.
Thermo의 Ribogreen assay kit를 가지고 mRNA 정량 실험을 쭉 진행중인데 원리로는 단순히 RNA에 형광이 붙어 분석이 가능하다고만 알고있습니다. Picogreen으로 하는 dsDNA는 정확한 매커니즘이랑 모든게 다 나와있는데 Ribogreen assay는 단순한 원리만 나오고 정확한 매커니즘은 아무리 서치를 해도 나오지 않아 이렇게 작성합니다. 정확한 매커니즘이 나와있는 지식이나 Reference가 있으면 알고싶습니다ㅜ
회원작성글 외계인눈깔아왱  |  2022.12.05
Q. CRISPR Cas9 RNA seq
CRISPR Cas9 을 해서 gene editing을 하였고 exon2번 바로앞의 intron에 point mutation을 일으켜서  splicing vasient를 기대하고  RNA seq 한 결과를 가지고 varient matching을 하였는데 하나도 splicing varient가 detec이 되지 않는다고 합니다. 그런데, RNA seq할 때 3' primer를 쓰면 PCR이 무너져서 그럴 수도 있는지 discussion을 부탁드립니다.    
회원작성글 새슬  |  2022.12.02
Q. 안녕하세요 실험에 고통받는 대학원생입니다. 도와주세요ㅠ
안녕하세요 실험에 현재 고통받고 있는 대학원생입니다. 지금 cell에 tet on/off system을 이용해서 doxycycline을 처리중인데요.. 저희 실험실에 doxycycline을 처리해본 사람도 없고 주변에도 없어서 따로 물어볼 곳이 없어 여기에 물어봅니다. 저는 현재 DMEM(10%FBS, 1xP/S) media를 사용중인데여 따로 분주해놓은 media에 doxycycline을 바로 넣어서 cell에 처리하고 있습니다. 이렇게 하는게 맞는지 잘 모르겠네요ㅠㅠㅠ  혹시 doxycycline을 사용해보신 고수님들께서는 어떻게 처리하셨는지 궁금합니다ㅠㅠ
회원작성글 또찌가또  |  2022.11.16
Q. realtime PCR 그래프
안녕하세요,   저는 RNA를 가지고 realtime PCR을 진행하고있습니다. 그런데, 결과가 증폭을하고 ct값도 읽히는데 그래프가 좀 쭈글쭈글하게 나오는 경향이 있습니다. 보정할 수 있는 방법이 있을까요? 기기는 quantstudio 5쓰고 있습니다.   감사합니다.
회원작성글 초코맛꿀  |  2022.11.11
Q. Nanodrop mRNA ratio 값 관련 질문
Nanodrop 장비(마이크로디지탈 NABI) 구매 후 처음 사용하는데 260/280 ratio가 2.0~2.2 까지 나옵니다. plate take 3 사용했을 때는 1.6~1.8 나왔습니다. 같은 sample 사용했구요. 혹시 문제가 무엇일까요??선생님들 도와주세요ㅠㅠㅠ
회원작성글 뉴트리아  |  2022.10.25
Q. complementary sequence 확인
T7을 가지고 transcription을 진행했는데 원하는 rna크기보다 좀 더 위에 큰 밴드하나가 더 나왔습니다. 그래서 templete sequence에 complementary한 부분이 있는지 확인해 보고 싶은데 하나하나 찾는 노가다 방법 밖에 없나요? 사용 가능한 Tool이나 다른 방법이 없을까요?
회원작성글 제is  |  2022.10.18
Q. bio-informatics관련 질문입니다.!!
안녕하세요! 박사과정 중인 학생입니다.   저는 휴먼 프라이머리셀에 단일 화합물질을 처리하여 무처리구와, 화합물질 처리구를 RNA 시퀀싱을 의뢰하여 DEG분석을 하였습니다.   이 과정중 궁금한게 있어서 질문 요청했습니다. 1. DEG로 나타나는 유전자로 기전 (mechanism)을 그릴 수 있을까요? 2. 궁극적으로 DEG로써 결론을 어떻게 내는 것이 최고의 답일까요? ex) fold change 값이 가장 큰 DEG를 선발하여 이 gene의 발현량이 가장 크게 차이났다. 라는 것으로 마무리 짓는건 너무 약해보여서요. 이제 공부 시작한 분야이기도 하고 능숙하지 않다보니, 전문가님들의  고견이 궁금합니다.   감사합니다.    
회원작성글 얗후  |  2022.10.07
Q. heatmap 그래프 보는방법을 모르겠습니다
rna-seq 하고 heatmap을 그렸는데 heatmap 그래프 읽는 법을 모르겠습니다!ㅜㅜ 빨간건 뭐고 파란건 뭔지 알려주실분 ㅜㅜ?
회원작성글 브라더소  |  2022.10.04
Q. RNA-seq 관련해서 질문드립니다.
RNA-seq 관련해서 셋팅을 진행하고 있는 대학원생입니다. Kallisto와 STAR를 이용해서 진행하고 있습니다.   1. Alignment tool별로 데이터가 유효한지 확인하기 위해서, Alignment tool 중에서 Kallisto와 STAR 를 둘 다 비교했는데요, FDR < 0.05 값들 중에서 많은 수의 DEG가 어느정도 유효함을 확인했습니다. 하지만 alignment 를 무얼로 했느냐에 따라서 FDR < 0.05 gene 들을 비교해볼 때, 대부분의 유전자에 대해서 LFC = -1.4 다른 한쪽은 -1.2 이런식의 섬세한 값차이가 있고, 몇몇 소수의 gene들은 LFC = -5.6, Fold change = -1.4 이런 큰 차이가 있습니다. STAR alignment시에 option이 너무 많아서 STAR를 잘못쓰는게 아닌지 하는 의심도 드는데요, 물론 method가 다르기 때문에, 다르게 나올 수 밖에 없다고 생각하는데, 이러한 섬세한 값 차이, 혹은 몇몇 소수의 큰 Variation 차이는 넘어가도 괜찮은지요? 당연히 발생하는 일인지요?     2. 일부 유전자에 대해서는 검증용 qPCR 을 진행했는데요, 저희 연구실에서 reference gene을 여러개 사용하는데, 검증용으로 qPCR 데이터를 보여줄때, RNA-seq상에서 유의미하게 FC 차이가 안나는 reference gene을 고의로 선정해서 검증해도 괜찮은지 궁금합니다. reference gene들을 RNA-seq상에서 확인해봤을 때, control vs experiment 에 따라서 RNA-seq 상에서 -0.6~06 log2FC 가 왔다갔다하는데, 만약 qPCR로 검증한 데이터를 publish한다면, 어떤 유전자로 정량한 값을 보여줘야하는지요?   고견 주시면 감사드리겠습니다.   감사합니다.    
회원작성글 신입입니다  |  2022.09.28
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