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BioLab 이은열 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA
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Q. Qiagen Rneasy mini kit로 RNA 추출
안녕하세요 실험에 대해서는 아예 모르는 초짜 대학원생입니다ㅠㅠ 졸업 논문을 위해 실험을 하게 됐는데, Cell에서 RNA를 추출해서 qRT-PCR을 돌려야 합니다. 현재 Qiagen RNeasy mini kit로 cell에서 rna 추출을 하고 있는데, 최소 6번은 했는데도 spectrophotometer로 흡광도 측정해봐도 아무것도 안 나와서 멘붕입니다.. 혹시 제가 하고 있는 과정 중 잘못됐거나 추가해야 될 점이 있으면 조언해주시면 감사하겠습니다ㅠㅠㅠ   *추출 전에 Buffer RLT 1 ml 당 B-ME 10 ul 첨가하고, Buffer RPE에 96-100% 에탄올 44ml 첨가했습니다*   *RNA 추출* 1. 6-well plate에 키우고 있어서 6 well plate 안 상층액 버리고, PBS로 wash했습니다. 2. RLT 350 ul 넣고 기울인채로 피펫 끝으로 긁어서 모이게 한 다음 튜브에 옮겨서 1분동안 vortexing했습니다. 후에 70% 에탄올 350 ul 넣고 피펫팅 10회 해서 섞었습니다. 3. 혼합한 700 ul를 spin column에 옮겨서 뚜껑 닫고 8500g에서 15초 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다. (그런데 이렇게 했을 때 막 위쪽에 하얗게 될 때도 있고 액체가 다 밑으로 안 내려올 때도 있습니다. Cell 양이 너무 많아서일까요ㅠ) 4. RW1 700 ul를 spin column에 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 15초 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다. 5. RPE 500 ul를 spin column에 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 15초 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다. 6. RPE 500 ul를 spin column에 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 2분 원심 후 밑에 모인 것 버렸습니다. 7. Spin column을 새로운 2 ml collection tube에 넣고 뚜껑닫고 10000g에서 1분 원심돌렸습니다. 8. Spin column을 새 1.5 ml 튜브에 옮기고 RNase-free water 40 ul를 spin column 막에 직접 넣었습니다. 뚜껑 닫고 8500g에서 1분 원심 돌렸습니다. 9. 8번에서 한 그대로 같은 튜브에 RNase-free water 40 ul를 spin column 막에 직접 넣고 뚜껑 닫고 8500g에서 1분 원심 돌렸습니다. 10. Spin column 제거하고 뚜껑 닫고 18 ul씩 4개로 나눠서 -80도씨에 보관합니다.   보관하기 전에 spectrophotometer로 아무리 재봐도 값이 안 나옵니다ㅠㅠ 너무 답답합니다.. 짚이는 것은 cell 양이 너무 많은지, 피펫팁으로 긁어오는게 너무 부족한지, vortexing을 너무 높은 속도에서 하는지, 알코올 넣고 피펫팅을 너무 조금 하는지 세게 하는지.. 이런 것들이 원인일까 싶기는 합니다ㅠ 추출은 실험대에서 하고 있고, 추출하기 전에 알콜로 소독하고, 피펫도 Rnazap? Rnase 제거하는 용액 뿌려서 닦고 피펫팁은 autoclave 돌린 것 사용하고 있습니다. 가운 입고 마스크 쓰고 말은 안하고 라텍스 장갑 끼고 rnazap 뿌려서 비빈 다음 진행하고 있습니다.   고칠 점 있으면 부디 알려주시기 바랍니다ㅠㅠㅠㅠ 감사합니다.
회원작성글 석나  |  09.25
Q. LNP Z-average(nm) 가 시간이 지나면서 감소할까요?
이틀전 mRNA를 LNP로 formulation해서 Z sizer로 파티클 크기를 측정했을때 120 nm 정도가 나왔습니다. 그런데 오늘 동일샘플을 다시 재보았는데 103 nm 정도로 약 20nm나 감소하였습니다. 이것이 어떤 원인인지 잘 모르겠습니다. 무슨 수치를 믿어야할까요? 만든 직후의 샘플과 만들고 4도씨에서 2일 store한 샘플의 차이가 무엇일까요? 버퍼, 온도 등 조건들은 동일하게 세팅하여 측정해서 그 원인은 아닐것으로 추정됩니다 ㅠ
회원작성글 깐깐징어  |  09.22
Q. siRNA in vivo delivery
안녕하세요 혹시 siRNA lipofectamine2000이나 3000으로 mouse에 delivery해보신분 있으신가요? intratracheal inhalation으로 전달하려고 하는데 시중에서 파는 invivofectamine 말고 lipofectamine으로도 가능한지 해서요. 어디선가 레퍼런스 본거 같은데 지금 찾으려니 도저히 못찾겠네요... 혹시 좋은 레퍼런스나 경험있으신분 있으신가요?  
회원작성글 ㄱㄴㄷ  |  09.22
Q. RNA추출 후 전기영동 밴드 첨부파일
안녕하세요. 발효식품(세균, 진균 모두 존재) 에서 RNA를 Trizol을 이용해 추출하였습니다. 전기영동(0.7% agarose, 135V, 20V)한 결과 밴드가 엄청 많이 나왔는데요,,, 첫번째 100bp ladder, 마지막이 1kb ladder이며 중간에 5개가 시료입니다. 밴드가 왜 이렇게 많으며, 각각 어떤 것인지 알 수 있을까요??
회원작성글 룰루야  |  09.20
Q. 나노드랍 이용한 RNA 측정 때 구아니딘 ITC
안녕하세요, 현재 병원성미생물로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하고, 그 cDNA를 RT-PCR 돌리는 과정을 하고 있는데요.   나노드랍 찍으면 가끔 Impurity 1 에 Guanidine ITC가 표기되고, Impurity 1 A260 및 Impurity 1 %CV 값과 그에 따른 Corrected (ng/uL)가 나옵니다.   이렇게 나오는 경우에는 RNA를 다시 추출하는게 맞을까요 아니면 그냥 보정된 Corrected 농도로 cDNA를 합성해도 별 문제가 없을까요? 그리고 Guanidine ITC가 나온다는건 washing이 덜 되었다는걸 의미하는걸까요?
회원작성글 촉새  |  09.19
Q. RT PCR Rna추출 과정에서 pellet이 보이지 않습니다..
안녕하세요. 현재 6well에 Raw cell을 seeding해 RT PCR을 진행하고 있는 학생입니다.  밑에 첨부한 사진과 같은 프로토콜로 진행하고 있는데, 세포가 많은 상태에서 진행함에도 불구하고 Rna isolation 과정에서 pellet이 거의 보이지 않으며, nano drop 260/280결과, Nucleic acid 농도도 굉장히 낮아 cDNA 합성을 진행할 수가 없는 상태입니다 ㅜㅜ.  (나노드롭 결과를 따로 정리한 파일입니다. )  rna 추출을 8번 이상 진행했는데도, 제대로 결과가 나온적은 한 번밖에 없습니다. ㅠㅠ 제가 RNA 추출 과정에서 세포를 죽이는 것 같은데, 아무리 생각해도 뭐가 문젠지 모르겠어 질문을 올리게 되었습니다.  모든 실험은 클린벤치에서 진행하고 있고, 지금까지 에탄올을 첨가할 때 조심스럽게 넣지 않았는데 그것이 문제인건지..? 아니면 트라이졸 피펫팅 과정에서 20번을 넘게 하기 때문에 세포가 죽어버리는건지 ..? 모르겠습니다 ㅠㅠ  미리 답변 감사드립니다!   
회원작성글 규규궁  |  09.18
Q. polysome profiling에서 x축이 궁금합니다.
안녕하세요, 논문을 보던 중 질문이 있어 글을 올리게 되었습니다. rna 번역에 대한 polysome profiling관련 아래와 같은 그래프를 보게 되었습니다. 제가 그동안 보았던 그래프들은 모두 x축이 sucrose gradient였고, 이는 원심분리와 관련된 것이라고 알고 있는데요.. 아래와 같이 fraction number라고 적힌 부분은 어떤 의미인가요? 너무 기초적인 질문이지만 답변해주시면 감사하겠습니다.  
회원작성글 lkdjf  |  09.17
Q. RT PCR primer product size
안녕하세요. RT PCR을 진행 중인데 product size를 알 수 있는 방법이 뭐가 있을까요?? sequence는 알고있는데 방법을 모르겠어요ㅠㅠ
회원작성글 avocado  |  09.13
Q. P/C/I 역할
rna 정제할때 phenol chloroform isoamyalcohol 사용하는데 이때 얘의 역할이 뭔가요..? 물보다 무거워서 핵산 침전 안되게끔 하는게 맞나요?
회원작성글 whoishe  |  09.08
Q. 특정 miRNA 농도를 확인하는 방법이 궁금합니다.
안녕하세요, miRNA에 대한 연구를 진행하고자 하는 석사과정중인 학생입니다. 현재 miRNA를 이용한 biosensor에 대한 연구를 하려고 하는데, biosensor를 할 때 miRNA를 농도별로 확인을 하는 과정이 있었습니다. 그래서 miRNA의 농도를 어떻게 구하는지 궁금해져서 논문들을 확인해보았는데, total miRNA의 농도를 확인할 때 이용한 kit들은 많이 소개를 해주고 있지만 특정 miRNA의 농도를 구하는 법은 딱히 언급해주지 않더라고요..! 그래도 표준 물질 첨가법을 이용하여 농도를 확인할 수 있다는 것을 확인했는데, 이를 제외하고 어떤 방법이 있는지 궁금해서 글을 남기게 되었습니다. 감사합니다!
회원작성글 바안지  |  09.08
Q. 저렴한 RNA extraction kit 추천 부탁드립니다.
안녕하세요. 대학원 석사과정생입니다. 실험 중에 cell에서 RNA extraction을 자주 하는데, 가격이 부담되어 기존에 사용하던 제품보다 조금 더 저렴한 제품이 있을까 해서 질문드립니다. 검색은 계속 해봤지만 종류가 워낙 다양한지라 선배님들께서 사용하시는 제품 중에 추천을 받을 수 있으면 좋을 것 같아서 질문드리게 되었습니다. 제가 기존에 사용하던 제품은 50prep에 230,000원(부가세 별도)인 제품입니다. 추천부탁드립니다. 감사합니다.
회원작성글 주먹밥김  |  09.05
Q. invitrogen] SYBR Gold 첨부파일
안녕하세요 오랜만에 젤을 내렸는데 SYBR Gold (Cat. S11494) 구매하고 처음 녹이고 실험했을때는 깨끗하게 잘나왔는데요 두번째 실험부터 먼지는 아니고 미세한 점이 생겨서 정량에 문제가 생겼습니다. 같은 실험결과를 보이시는 분들도 있고  현재 0.4um 필터해도 나오는걸로 봐서 염색약문제 인거 같습니다. 비슷한 결과 나오신분들 조언 구합니다.    
회원작성글 135nicb  |  09.05
Q. Trizol RNA prep
cell 에서 RNA prep 하려고 Trizol에 넣고 보관하기 위해서 5분정도 -80도에 넣었다가 샘플을 다 못넣은걸 늦게 발견해서 37도로 빠르게 해동하고 샘플 다시 넣은 다음 -80도에 넣었는데 혹시 RNA에 많이 안좋을까요? 아마 RNA가 그 시간 동안 cell 밖으로 나오진 않았을 것 같아서요
회원작성글 별헤는밥  |  09.04
Q. 전사체분석 유전자선발 관련 질문입니다 첨부파일
저는 DEG를 탐색하여 log2fold change를 통해 걸러내고, 그 후 여러과정을 통해 후보유전자를 걸러내고있습니다. 이제 거의 최종적으로 FPKM을 보고 발현값이 낮은 값을 걸러내려고 하는데, 사진과같이 W30~M100까지 6가지의 항목전체가의 FPKM이 10이하일 경우 제거를할려고 합니다. 그렇게되면 사진과 같이 주황색으로 표시한것이 남게되는데, 이렇게 발현값이 낮은것을 주관적으로 걸러도 되는건지가 의문이 들어서 질문남깁니다. 논문쓰기에는 이전 선발 기준에 비해 뭔가 unscientific한 느낌이 들어서요ㅠㅠㅠ   답변주시면 감사하겠습니다!!    
회원작성글 윤주쓰  |  09.02
Q. DNase I 처리 했는데도 RT(-) 샘플에서 Ct값이 뜹니다..
대조군과 실험군 RNA를 뽑은 후에 DNase I (Phenol/Chloroform extraction으로 inactivation 함) 처리를 하고 cDNA를 합성했습니다. 각각 RT(+)와 RT(-) 샘플을 만들어서 qPCR을 진행했는데 실험군에서는 RT(-)에서 Ct값이 안뜨고 대조군의 RT(-)에서는 Ct값이 뜨는걸 확인했습니다. (negative control인 water에서는 ct값이 안떴습니다.) 같이 DNase I 처리를 하엿는데 왜 대조군 샘플에서만 RT(-)가 뜨는 걸까요..? 아예 RNA 단계에서부터 오염되서 그런걸까요.,,.? 근데 오염됐다고 해도... DNase I처리하면서 purification이 됐다고 생각했는데...ㅠㅠ 어떻게 해야 하나요?? 고수분들 도와주세요..!
회원작성글 soor  |  08.30
Q. rna seq중 트리밍한 데이터를 ncbi에 올려도될까요?
저널에 투고중에 ncbi에 어세션 넘버를 넣으라고 해서 제 로우 데이터를 확인했더니 한샘플이 포워드 시퀀스 데이터가 없더라구요 ㅜㅜㅜ 트리밍한 데이터는 다있는데 이럴경우 트리밍한 데이터로 SRA에 등록해도 될까요...?
회원작성글 오오오오복  |  08.29
Q. RNase A 처리에 대한 질문(Unit 관련??)
RNase A 계산과 처리 하는데 확신이 없어 질문 드리겠습니다. 1. 제가 만들려고 하는 RNase A 의 specific activity 50 U/mg 입니다. 1mg/ml 로 만들어진 stock이 있으니 이건 50U/ml 짜리가 되겠지요. 참조하는 논문에서 1U/ml로 처리 하는 것으로 확인하여 50배 희석하여 준비를 하였습니다.  그런데 갑자기 헷갈리는게 현재 처리하고자 하는 sample의 total voulme이 (200ul)과는 상관없이 처리 하는 건지 헷갈리내요!!(단순히 어떤 시약과 함께 RNA가 없다는 것을 한번  보기 위한 것이라서 농도 측정은 무시했습니다)   RNA 농도와 상관없이 total volme은 상관없을까요?? 2. 그리고 몇 U인지 모르는 1mg/ml RNase A 10ml이 얼려져 있는데,, 이건 사용 하면 안되겠죠? 예전 선배님이 한가득 만들어 놓으신거 같은데......   헷갈리는 질문에 답변 해주셔 미리 감사드리겠습니다.
회원작성글 결과를내는삶  |  08.26
Q. RNA 전기영동
rRNA 추출 후 전기영동을 하였는데 밴드 퀄리티가 이렇게 나오게 되었습니다. 겔 조성은 2%로 조금 높게 만들긴 했는데 Smear되서 밴드가 나왔네요. 이정도로 cDNA 합성후 PCR을 진행해도 될까요...? ㅠㅠ
회원작성글 임노코  |  08.16
Q. Elution buffer로서의 RNase-free water 역할
안녕하세요 제가 QIAGEN의 RNeasy Plus Mini Kit라고 RNA prep, RNA isolation을 위한 kit를 사용중입니다. Kit 안에 포함되어있는 여러 buffer들의 원리를 찾아보고 있었는데, 최종단계에서 elution buffer로 사용되는 RNase-free water가 어떠한 원리로 Pure RNA를 얻게 도와주는지 궁금해서 질문드립니다. 감사합니다.
회원작성글 Foxcatcher  |  08.11
Q. RNA Isolation 하고 nano drop을 찍으면 항상 농도가 적게나와요
안녕하세요! 현재 RT-PCR을 배우고 있는 학생입니다. 다름이 아니라 RNA를 추출하고, Nano drop을 찍으면 항상 Nucleic acid conc가 적게 나와서 고민입니다.. 평균적으로 50ng/ul이 나오는 것 같은데 혹시 이런 상황일 때 RNA 추출에서 주의해야할 점이 있을까요? 프로토콜 그대로 하고있다고 생각하는데 항상 이 값이 적게나와 다음 cDNA 합성 단계를 진행하지 못하고 있습니다 ㅜㅜ.. 마지막 단계에서 원심분리를 하면 펠렛이 Ep tube에 확실히 보이긴 하는데 나노드롭만 찍으면 값이 낮게 나오더라구요 Trizol에서 세포를 강하게 피펫팅 하는 과정에서 기포가 많이 생겨서 그런건지 아니면 Trizol에서 너무 오래 처리를 해서 그러는지 ㅜㅜ 혹시 조언좀 구할 수 있을까요? 
회원작성글 공공펄  |  08.09
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