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BioLab 이은열 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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Q. protein extraction 후 protein 농도에 관한 고민이 있습니다.
안녕하세요, 매번 검색만 하다가 처음 질문 남겨봅니다.  protein extraction을 하고 정량을 했는데 protein 농도가 터무니없이 적게, 거의 안 넣었다고 봐도 될 정도로 나왔습니다. 샘플마다 값도 너무 튀고요.. 동일한 조건으로 이전에 실험했을 땐 이정도로 적게 나오진 않았어서 매우 당황스럽습니다.. 제가 복기 해봤을 때 기존과 크게 다른 점이 없어서 너무 답답합니다. 앞으로 이 분야를 더 배우고 싶은데, 단백질 추출도 못하면 무슨 실험을 진행할 수 있겠나 싶어서 막막합니다. 제가 아직 학부생이라 부족한 점이 많습니다... 제가 한 실험 과정과 정량 후 결과값은 아래에 첨부해두었습니다. 잘 부탁드립니다. lung cancer cell 4*10^5으로 6well에 seeding >> 18h 후 80%정도 찬 것을 확인 후, 시료처리 >> 24h 후 protein extraction <extraction> 1. media suction 후 well당 cold DPBS 1mL로 washing >> suction후 cold DPBS를 well당 1mL씩 넣고 스크래퍼로 긁어준 뒤 따서 e-tube로. 3000rpm, 5min, 4℃ centrifuge ; 여기까지 진행했을 때 처리한 시료 농도가 높았던 샘플 하나(B3라고 하겠습니다)가 pellet이 안 보였습니다.   2. 상층액 suction 후 RIPA solution 넣고 강하게 피펫팅 >> 강하게 볼텍싱 >> ice에 꽂아놓고 20min incubating(5min 간격으로 강하게 볼텍싱 해줬습니다.) ; RIPA+P.I.+PMSF를 1:0.01:0.001로 섞어서 RIPA solution을 만들었고, 위에서 언급한 B3는 20uL로, B3를 제외한 나머지 샘플들은 80uL로 pellet을 풀어줬습니다.  피펫팅은 100uL짜리 피펫으로 거품이 날 정도로 세게 여러번(제 체감상으로는 한 40번정도 피펫팅한 것 같아요)했습니다.   3. 15000rpm, 20min, 4℃ centrifuge >> 상층액만 따서 새 e-tube에 넣기 ; centri 끝나고 나니까 첫 centrifuge 사용때보다는 줄었지만 pellet이 보였고, B3에서도 아주 조그만 pellet이 보였습니다.  상층액은 80uL로 푼 샘플들은 75uL, 20uL로 푼 샘플은 15uL정도 딸 수 있었습니다.   4. 정량 1, 2, 3, 4, 5는 standard A1~3, B1~3은 sample입니다.(A1, B1은 CTR)   1 2 3 4 5 A1 A2 A3 B1 B2 B3 DDW 18 14 10 6 2 18 18 18 18 18 18 RIPA 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0 0 sample 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 BSA 0 4 8 12 16 0 0 0 0 0 0 DC A 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 DC B 800 800 800 800 800 800 800 800 800 800 800 단위 : uL 표와 같이 조합 후 볼텍싱해주고 상온에서 15min incubating >> 96well에 well당 200uL씩 넣고 750nm 흡광도 촬영   5. 계산 표 윗줄은 최근 실험 결과, 표 아랫줄은 이전 실험 결과입니다. R^2   A1(CTR) A2 A3 B1(CTR) B2 B3 0.9906 1uL당 농도 0.579531 0.265105 0.295931 1.424168 1.07275 0.172626 0.9902 1uL당 농도 1.005952 0.809524 0.815476 2.029762 1.863095 1.369048 현재 이런 상황입니다. 저희 랩실 사람들이 80uL로 풀었을 땐 대부분 람다당 농도가 1은 넘습니다. 저의 고민은 1. 왜 람다당 농도가 거의 0에 수렴하는가? 2. 왜 람다당 농도가 샘플마다 이렇게까지 차이가 나는가?(추출 전 육안으로 cell상태 확인했을 때 confluency랑 비례하지도 않음..) 이렇게 두 가지 입니다. 제발 문제점을 파악해서 잘 해결될 수 있으면 좋겠습니다..
회원작성글 맞는길을고르지  |  09.23
Q. 핵, 세포질 분리 시 lysis buffer가 세포막에만 특이적으로 반응하나요?
4.8. Preparation of Cytosolic and Nuclear Extracts  Cells were treated and harvested as described above, lysed with hypotonic lysis buffer [25 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulphonic acid (HEPES; pH 7.5), 5 mM EDTA, 5 mM MgCl2, and 5 mM dithiothreitol (DTT)], and incubated for 15 min on ice. NP-40 (2.5%) was added and the cells were lysed for an additional 10 min. Nuclei were collected by centrifugation at 7500× g for 15 min at 4 ◦C. The supernatant was collected as the cytosolic fraction. Nuclear proteins were resuspended extraction buffer (10 mM HEPES, pH 7.9, 100 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, and 0.2 mM DTT) and incubated for 20 min at 4 ◦C. Extracts were centrifuged at 16,000× g for 10 min, and protein levels were determined using a BCA protein assay kit (Pierce; Thermo Fisher Scientific, Inc.) according to the manufacturer’s instructions. Both fractions were then used for Western blot analysis.   라고 나와있는데, 이처럼 세포질 내의 단백질을 추출하고, 핵 내의 단백질을 따로 따로 추출할 때, 이 때 사용되는 lysis buffer에 의해 핵막은 붕괴가 안 되는걸까요? 어떻게 선택적으로 같은 '인지질'에 영향을 주는 buffer 임에도 불구하고 핵막에 손상을 주지 않고 핵 내의 단백질을 얻을 수 있는지 원리가 궁금합니다!   좀 쉽게 상세히 설명해주시면 감사하겠습니다! 부탁드립니다!!
회원작성글 콜록콜록  |  09.21
Q. biotin을 polyethylene에 부착하는 방법이 있나요?
200-300ulm사이즈의 polyethylene의 표면에 biotin을 코팅하고 싶습니다. 정확한 protocol을 알려주세요. 또한 biotin을 일부 면에만 특이적으로 코팅할 수 있는 방법도 있다면 알려주세요.
회원작성글 쿵짝짝쿠쿠루핑퐁  |  08.30
Q. 고등학교 생물 실험 관련하 !! 도와주십쇼
고2구요 실험 하고 레포트를 써야해요 ㅜ 추상적이라 구체적으로 계획해야 하는데 주제는 가장 늦게 부폐되는 마스크는 무엇인가에요. 마스크 4개 정도 준비하고 각 마스크에 사과를 넣습니다 . 사과는 알콜을 묻힌 사과 , 비누를 묻힌 사과, 식초 , 가글? 총 4개 생각중이에요. 이 중에서 소독기능이 나은 것을 찾는게 ? 목적이긴 한데 실험 방향성과 실험 목적 절차를 어떻게 잡아야할지 너무 막막해서요 ㅜㅜ 생물 과학 잘 하시는분들 좀 도와주세요 ㅜ급한거랍니더...
회원작성글 밍밍밍밍  |  08.30
Q. Free - Calcuim buffer의 조성이 정해져 있는 건가요?
안녕하세요 유산균의 CEP 관련 탐구를 진행하고자 하는 학생입니다.  여러 선행 논문을 찾아보는 중 제목에서 처럼  Free - Calcuim buffer에 배양함으로써~라는 문구가 나오는데 이 Free - Calcuim buffer가 뭔지 모르겠습니다...! 단순히 칼슘이 없는 버퍼인건지 아니면 특별한 조성이 있는건지 의문이 생겨 글 남깁니다. 감사합니다!
회원작성글 choish1210  |  08.10
Q. protein extraction
cell을 harvest 하고 western을 진행하기 위해 protein extraction을 기계로 결과값을 내는데요. protein 농도가 마이너스가 나오는 경우는 왜 그런건가요ㅜㅜ?   lysis buffer는 늘 같은 걸로 이용을 해왔는데 언제는 값이 잘 나오다가 언제는 마이너스 나오고 참 들쑥날쑥 한데 이 원인이 왜 인지 혹시 저같은 경험 해보신 분 계신가요 ㅜㅜㅜ? cell lysis가 충분히 되지 않은 것 같은 경우도 생각해서 충분히 lysis 한 후 4도씨에서 rotation 하고 15000rpm, 15min centri 진행 하고 protein assay 용액 500ul에 protein 2ul 넣고 96 well에 200ul씩 2번 분주 하는데요    마이너스 값이 나오는데 왜 그러는 건가요ㅜㅜㅜ
회원작성글 열두시삼십분  |  08.10
Q. Dialysis buffer 관련 질문드립니다.
Dialysis과정은 처음 해보는 실험이라 모르는게 많습니다..  사용중인 protein이 urea에 용해되어있는데, 이 urea를 다른 buffer로 exchange해주고싶어요. 현재는 총16시간 dialysis를 하고 한번 buffer 교환을 해주는데 어느정도의 buffer와 시간을 얼마나 해야 완전히urea가 다 빠져나오고 buffer change 되는지 잘 모르겠습니다. 계산하는 식이 있는것 같은데 잘 안나오네요.. 혹시 아시는분 계신가요 혹시 관련해서 도움될만한 책이나 자료로 추천해 주실만한게 있나요?
회원작성글 폰지밥  |  08.04
Q. NLS와 NES를 모두 가진 단백질이 세포 외부에서도 발견 가능한가요?
안녕하세요, 이공계 관련 공부를 하는 사람은 아니고 국어 관련 일을 하는 사람이지만 도움을 구하고자 질문드려 봅니다..   올해 법학적성시험 언어이해 영역에 단백질의 합성과 수송에 관한 소재가 출제되었는데, 이와 관련한 질문입니다.   결론부터 말씀드리자면, NLS와 NES를 모두 가진 단백질(이하 ㉠)도 세포 외부에서 발견이 가능한가요?   출제된 지문의 내용에 따르면 세포 밖으로 분비되는 단백질은 소포체 위의 리보솜에서 합성된 것이어야 한답니다.   그런데 NLS는 세포질에 독립적으로 존재하는 리보솜에서 합성되어 세포핵으로 들어가는 단백질이 가지고 있는 신호 서열이라는 점으로 미루어 보아 ㉠은 세포질에 독립적으로 존재하는 리보솜에서 합성된 녀석 같은데요..   그렇다면 ㉠이 세포 외부에서 발견되는 것 자체가 불가능한 것 아닌가 하는 의문이 듭니다.   전공이 국어교육이다보니 정확하게 파악하는데 한계가 있네요.. 제 의문이 맞는지 확인 부탁드립니다 ㅠㅠ
회원작성글 국어귀신  |  07.29
Q. protein extraction에서 urea buffer 대신 RIPA buffer 사용가능한가요?
정말 급한데 알려주실분 계신가요? protocol에서 protein extraction 과정 후 urea buffer에서 lysis 시키는 과정으로 나왔는데 혹시 RIPA buffer로 대체해도 가능한지 궁금합니다. fungi protein extraction입니다.
회원작성글 가별  |  07.12
Q. Plasmid prep 관련 질문입니다.
안녕하세요.  단백질 관련 실험을 하다가 궁금한 부분이 있어 질문드립니다. 먼저 sample 을 transformation -> incubation / IPTG induction  후  plasmid prep을 진행 해도 되는 건가요????      
회원작성글 mito59  |  07.06
Q. 단백질 사서, 녹일 때 4mM HCl로 녹이는 이유?
단백질 관련한 실험을 진행하려고 단백질을 샀는데 powder로 왔습니다. 저에겐 생소한 4mM HCl로 녹여서 사용하라는 guide를 받았는데   제 단백질이 산성의 조건에서 안정한 단백질이라 4mM HCl로 녹이라는건가요? 아니면 특별한 이유가 있나요??
회원작성글 공부하자공부  |  07.05
Q. 펠렛 회수
안녕하세요, 약물전달시스템을 연구하고 있는 대학원생입니다. solid lipid nanoparticle에 로딩된 커큐민(노란색) 물질의 양을 측정하기 위하여, sucrose gradient density centrifugation 방법을 사용하고 있습니다. 원심분리를 통해 로딩되지 않은 커큐민이 마이크로 튜브 아래로 가라앉히는데는 성공하였습니다. 로딩되지 않은 커큐민만을 정량해야해서, 셈플이 펠렛에 직접 닿지 않아야하는데 펠렛을 회수할 적절한 방법이 떠오르지 않습니다. 파이펫으로 위에 떠있는 셈플을 깔끔하게 딸 수도 없고, 아래의 펠렛만 회수하자니 파이펫에 셈플이 묻어나와 오차가 너무 클 것 같습니다.... 이런 경우에는 어떤 식으로 셈플을 회수해야하는지 조언 부탁드립니다.  
회원작성글 doxxx  |  06.20
Q. SDS-PAGE 분석
Protein 정제단계에서 얻은 각각의 sample을 SDS-PAGE 분석을 했는데 Ladder, Uninduced, Induced, Sup, pellet, LT, WT, His 순으로 sample을 loading했습니다. 각 위치마다 밴드가 다르게 나오는데 그 이유가 무엇인가요?
회원작성글 바이오팜  |  05.30
Q. pro-prep 사용해서 protein extraction할 때 pellet
pro-prep을 이용해서 cell에서 protein extraction하고 있습니다.   cell pellet을 pro-prep에 resuspension 후 -20C에서 30분 인큐베이션하고, 13000rpm 4C 5min centrifuge 하고 sup만 따내서 냉동에 보관하면 된다고 알고있습니다.   그런데 마지막 단계에서 centrifuge 한 후 pellet이 따로 보이지않습니다. 그래서 그냥 etube 맨 아랫부분에 팁 안 닿게해서 sup만 따내는데... 괜찮은가요?   nano drop 찍어보면 protein 양도 괜찮고 260/280 값도 1.5 이하로 괜찮은 것 같습니다. centrifuge시간을 10분까지 늘려봤는데도 pellet이 분리되진않네요.. 괜찮은가요?
회원작성글 마리포사  |  05.20
Q. sonicator duty cycle 계산
안녕하세요! sonicator로 단백질을 확보하려고 하는데 duty cycle에 대해 궁금한 점이 생겨 질문합니다! Duty cycle = (신호가 켜져있는 시간/신호의 주기)*100 (%) 로 계산한다고 하는데, 논문에 2 min, 2s on, 2s off, 40% duty cycle이라고 작성되어 있었습니다. 계산식에 의하면 50% duty cycle이라고 생각하는데 이게 맞을까요?? 40% duty cycle이라면 2s on, 3s off 로 설정하면 될까요.... 그리고 2 min이 총 작동 시간이라는 것을 의미하는 건가요?  
회원작성글 으아앙ㄱ  |  05.18
Q. Bradford 희석배수 문의드립니다...
안녕하세요... 실험을 하다가 도저히 모르겠어서 질문드립니다... 실험시 standard -Final : 20ug/mL BSA = 1X dye 1000ul + 2mg/ml BSA 2ul 후 serial dilution 하여 1.25ug/mL 까지 만든 후 96 well 에 200ul씩 분주   Sample -unknown sample 2ul+1x dye 500uL 하여 96well 에 200ul 씩 분주합니다.    이후 추세선 값에 sample 의 od를 넣어 x 값이 나오게되는데 이후를 모르겠습니다.   제가 20ug 를 사용한다면 20/x값 이렇게 계산해야할 것 같은데 희석배수는 어디에 들어가며 이 경우 희석배수는 몇인가요..?   도와주세요....ㅜㅠ
회원작성글 페이퍼_리  |  05.17
Q. TLC에서 아스파르트산의 전개
에틸 아세테이트와 아세트산을 20:1의 비율로 혼합한 전개용매를 사용한 TLC판에 아스파르트산의 기름층을 spotting했을 때, 254nm의 UV로 비추면 보이지 않는데, 그 이유가 아스파르트산의 극성이 너무 커서인 건가요? 아니면 다른 이유가 있나요??
회원작성글 실험은어려워힝  |  05.13
Q. Mouse brain lysate 중 perfusion여부
안녕하세요, mouse brain lysate를 이용하여 stereotaxic injection을 수행하려고 하는 석사생입니다. Brain lysate를 만들어야 하는데 궁금한 점이 있어서 질문드립니다. 여러 논문들에서 찾아낸 brain lysate의 과정은 1. Mouse에서 Brain 적출 2. Homogenize한 뒤 Sonication 3. centrifuge하고 난 뒤 Supernatant만 사용 입니다. 여기서 Perfusion은 언급되어 있지 않더라구요. Perfusion을 해서 피를 빼낸 후에 해야 하는건지, 아니면 있는 그대로의 Brain을 바로 homogenize하는 것인지 알고 싶습니다.
회원작성글 2Conomy  |  05.11
Q. 메탄올 필터
제가 메탄올로 물질 추출 진행 후 DW를 동량 첨가해 50% 메탄올에 녹은 상태였고 원하는 물질은 methanol이나 dmso에 녹는다고 했습니다 (dw는 안녹을 가능성이 훨씬 높아요) 이 샘플로 MS를 찍기 위해서 필터링을 했는데 아무 생각없이 CA filter류 필터했습니다ㅠㅠ 1미리를 필터했더니 절반밖에 안나오길래 1미리를 더 필터하니 1미리양이 되더라구요.. 그때 생각을 못했는데 CA 필터가 가끔 메탄올 필터 가능하다는 말들이 있던데 필터가 안된걸까요? 제가 원하는 물질이 필터에 걸려서 안나온 걸까요? ㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 ziw  |  04.27
Q. 단백질 발현SDS-PAGE시 K-dalton 계산하는법?
sds page시에 단백질 사이즈를 봐야합니다  제단백질 사이즈는 대략80~kdal정도 되는데  단백질사이즈 kdal이런거는 어떻게 계산해서 확인하면되나요  소중한 지식 공유 부탁드립니다 ㅠㅠ ! 
회원작성글 choheec  |  04.25
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