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BioLab 박소정 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
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Q. 단백질 정제(protein purification), SDS-PAGE 결과 첨부파일
marker/pellet/sup/ub/wash/imidazole200/imidazole400 순으로 sds-page 를 달렸는데, 단백질 발현이 제대로 나타나지 않은 이유가 뭔가요?
회원작성글 vitto  |  11.26
Q. 단백질 발현 시 크기
안녕하세요. 저희 실험실에서 단백질 발현 시에 over-expression vector로 pET28a(+), pET32a(+) vector를 사용합니다. 저희 실험실에 선배가 알려주시기를 과발현된 단백질의 크기를 확인할 때 pET28a(+) vector는 5kDa, pET32a(+) vector는 15kDa를 더해서 제 단백질 크기를 정하면된다고 하십니다. 저희 실험실에서는 주로 N-terminal의 His-tag를 사용하는데요. 제가 pET28a(+)를 사용한다고 하 때 N-terminal의 His-tag - Bam H1까지 아무리 계산해도 5kDa가 안나오거든요... 단백질 크기를 계산할 때 어디서부터 시작해서 크기를 계산해야하나요???
회원작성글 Worker  |  11.15
Q. in vitro translation이 뭔가요
제목 그대로 in vitro translation이 뭔가요? 구글링해도 잘 모르겠네요ㅠㅠ 프로토콜을 어떻게 되는건가요
회원작성글 빙글뱅글  |  11.13
Q. 효소 안정성 테스트 중에 데이터가 튀는 경우 질문드립니다.
안녕하세요 선배님들  제가 효소 안정성 테스트를 하고 있는데요.. 단백질 분리정제 한 시점부터 (NAD, NADH) 속도를 이용한 Kinetics assay로 24시간 마다 활성을 측정하고 있습니다.   단백질 분리정제는 His-tag을 붙여서 Ni-NTA로 분리정제 하고 있고, buffer change도 하고 난 후 실험 진행하고 있습니다.   그런데 여기서 문제인 점이... 효소 활성이 시간에 따라 떨어지는것이 당연하다고 생각하는데.. 효소 활성을 샘플을 찍는 시간마다 NADH의 감소량을 측정하면 점점 떨어지는 것이 아니라 활성이 높아졌다가 낮아졌다가 그럽니다.. (0h)에 찍은 NADH Absorbance 값이 -0.35라면.. 점점 떨어져서 -0.33, -0.30 이런식으로 되어야하는데.. -0.35, -0.33 ,-0.34, -0.32 이런식으로 들쭉날쭉합니다...   잃었던 활성이 돌아오지는 않을 것 같은데,. 뭘 놓치고 있는 걸까요 ㅠㅠㅠ
회원작성글 효소공부하자  |  11.13
Q. 단백질을 purification 후 단백질이 사라져요 ㅠㅠ
단백질 정제후 buffer change 후 0.2um Filter 로 처리하면  타겟 단백질들이 다사라져요 ㅠㅠ 타겟 단백질의 mw 은 10kda 정도 되는데........ 이런적은 첨이에요 ㅠㅠ SDS-PAGE 를 걸어보면 다른건 다나오는데  필터 처리후 는 아무것도 보이지 않네요 ㅠㅠ  버퍼도 계속 제가 만들어서 사용하는데 ㅠㅠ 이유를 알수가 없네요 ㅠㅠ  갑자기 잘나오던 단백질이 안나오니 답답하네요 ㅜㅜ
회원작성글 mito59  |  11.02
Q. 단백질 정제위한 cell 수
단백질 정제하기위해 cell키워서 카운팅하고 필요수만큼 계산해서 6well 플레이트,100pi , large culture. 이것 sup으로 단백질정제하던데요.4각 격자에 모서리에 걸쳐있는것은 2개 모서리의 셀만 포함시키는데 수가 그렇게 중요한가요? 카운팅수가 잘못되면 무슨 문제가 발생하는지 궁금합니다. 예를들어 276x10^4인데 300x 10^4으로 수를 세서 계산하면 완전 다른 단백질이 ㅇ산들어지나요?
회원작성글 BBlue  |  11.01
Q. protein purification 질문입니다.
잘나오던 타겟 단백질이 갑자기 안나오는 이유가 뭔지 답답해서 질문드립니다. ㅠㅠ 단백질 정제후 마지막에 mes로 buffer change 를 진행하는데 ㅠㅠ 정량한 값을 보니 거의 나오지 않네요 ㅠㅠ SDS-page 도 확인 해볼꺼긴 하지만 ...  혹시 mes buffer 제작할떄 100mM 로 만들어서 희석해서 사용합니다, mes mw 195.25 100mM (500ml 기준)  mes 9.763+ DW 400ml 후 0.2um 필터 처리후 PH 맞춰서 진행하는데 문제가 있는걸까요...??? 아님 제가 mes를 덜녹여서 그런건가요...  답변 부탁드립니다 
회원작성글 mito59  |  11.01
Q. coomasie염색,정량
 1.SDS-PAGE gel 쿠마시염색 질문입니다.  쿠마시 15ml에 gel 넣고 15분 shaking 후  이후 물로 세척? 어떻게 얼마동안 세척후 사진 찍거나 정량하면 되는지요?   2. BSA를 2ug 1ug 0.5ug 0.25ug 로  샘플 만든뒤SDS-PAGE GEL run후 단백질 정량하는데  BSA를 2ug 1ug 0.5ug 0.25ug 가 10ul(buffer포함)에 들어가게 샘플 만들기  이게 어떻게 한다는것인지 알려주시면 감사하겠습니다.      
회원작성글 BBlue  |  10.31
Q. furin protease transient expression해보신 분 있나요?
HEK cell에서 furin co-transfection시켜서 target protein의 acitvation을 하고 싶은데요.  ref를 타고 올라가도 furin sequence에 대한 정보가 잘 없네요ㅠ  1990년대 논문들이고.. human furin을 사용한다는 것은 확인했는데,  그냥 pcDNA 3.1 vector에 human furin construct 대략 ref에서 찾은 resiude number만큼 truncation해서 target protein과 co-transfection하면 될까요? 합성했는데 발현이 안될까봐 걱정이네요.. 도와주세요ㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 브뤽커  |  10.28
Q. protein exclusion gel run 정량 첨부파일
단백질 purification 후 size exclusion해서 원하는 peak에 나온 것들 모아서 centricon에 농축합니다. 최종적으로 농축 끝나면 SDS GEL 에서 BSA농도와 비교해서 코마시염색한 파란색의 두께? 측정해서 농도를 재는 이유가 뭔가요? 농축할때 나노드랍으로 농도측정하던데 이걸로는 부족한가요? 읽어주셔서 감사드립니다.
회원작성글 BBlue  |  10.28
Q. Protein purification
단백질 정제 초보자입니다. 버퍼만듭니다 . 1.Washing buffer 20mM Tris(pH 8.0) 200mM NaCl 는 최종vol.은 dw에 넣어서 만듭니까? 2 .elution buffer 위의 워싱버퍼에 imidazol 20mM, 200mM 300mM 짜리 만드는데 이것들도 dw넣고 만들면 되나요? imidazol 워싱하고 남은버퍼 버리던데 뒀다가 다음에 쓰면 안되나요? 3.Size exclusion할때는 위의 washing buffer를 DEPC water 로 만들던데 특별한 이유 있을지요? 설명 감사드립니다.
회원작성글 BBlue  |  10.28
Q. protein centricon농축
단백질 size exclusion해서 뽑았고 농축위해 1.centricon에 넣은뒤 원심분리 1800rpm5분돌리고 con위에 아직 남아있는 것에 파이펫팅 몇번하고 나노드랍정량 하던데 왜 파이펫팅 하나요? 2. 5분 센돌이 돌리고 양이 줄어든거 보면서 정량 2회째에 5분 돌리고 또 정량 계속 이렇게 매번 정량해야하나요? 센돌이 5분후 줄어든거 확인하고 2,3회 센돌이다운후 이때 정량하면 안되는가요? 단백질 샘플 계속 정량하니 아깝단 생각이 들어서요. 미리 설명 감사드립니다.
회원작성글 BBlue  |  10.28
Q. heat shock protein 60(CJ1) promoter
단백질 발현이 잘 안되어 글을 써봅니다. 제가 사용하고 있는 프로모터는 HSP60 혹은 CJ1이라고 불리는 프로모터를 사용하고 있는데, 발현이 잘 되지 않습니다. 여러 변수를 조절하고있는데(ori, 백본, 터미네이터 등..) 조건은 다 괜찮은것 같습니다.. 그래서 발현을 시키는 과정에 있어서 문제가 있는 것은 아닌가 싶습니다. 제가 현재 궁금한 것은 이 프로모터가 상시발현이라고 알고있어서, 따로 특별한 과정은 거치치 않고 있는데, 혹시나 승온을 해야하는 프로모터일 수 있겠다는 생각이 들어 글을 올려봅니다. 혹시 저처럼 이 프로모터를 이용해서 발현을 시켜보신 분이 계실까요? 어떤 의견이든 남겨주시면 정말 감사하겠습니다. 
회원작성글 우제리  |  10.22
Q. 정제 공정 입문
안녕하십니까 브릭 회원님들 이번에 전공과 다른 바이오 회사에 입사하여 정제공정을 맡게 되었는데 기초조차 없어서 도움받고 싶어 작성하게 되었습니다.   affinity > > aex or cex 이렇게 정제공정이 진행되는 것으로 알고 있는데 chrom 공정 순서는 왜 이렇게 정해지는지   Protein A, His-tag, 이런 것들은 어떻게 이해하면 될까요??   단순히 공정순서만 암기하고 있었는데 이유도 모르고 외우는 제 자신이 좀 무능해보이네요.. 부탁드립니다.! 
회원작성글 득근단백질  |  10.21
Q. 흡광도 분석에서 미지시료 답을 구하는 과정에서 질문이 있습니다
학부생 2학년 실험에서 흡광도 분석을 했었는데요 standard curve를 구하고 미지시료의 흡광도를 y값에 넣으면 x인 미지시료의 농도가 나오잖아요. 근데 미지시료의 흡광도를 한 번 희석했을 때의 농도를 구하려고 할 때, 흡광도를 2배해서 x값을 구하는 것과  흡광도를 대입하여 x가 나오면 그때의 x에 2배하는 과정의 차이가 뭘까요..?
회원작성글 에오  |  10.19
Q. Ni NTA를 이용하여 단백질 정제시 단백질의 농도는 어떻게 정량하나요?
안녕하세요. 재조합 단백질을 만들고 있는 대학원생입니다. 제가 Ni-NTA를 이용하여 재조합 단백질을 정제한뒤 500mM의 이미다졸이  들어있는 Elution buffer를 이용하여 용출 하였습니다. BCA를 이용하여 단백질을 정량하고자 했는데 BCA로 정량시 과량의 이미다졸 때문에 단백질 농도가 잘 나오지 않았습니다. 그래서 혹시하하는 마음에 SDS-PAGE를 내렸는데 단백질이 제대로 정제되어 나왔습니다. 이미다졸로 용출한 재조합 단백질을 어떤 방법으로 정량할 수 있는지 궁금합니다.  
회원작성글 kugamon  |  10.13
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