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BioLab 이은열 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
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Q. Transfection 조건
안녕하세요 현재 293T pei transfection 과정 중 고민이 있어 남깁니다. 저는 원래 예전 박사님께 배운대로 Cell을 10cm dish에 3x10^6cells를 깔고 dna 18 ug pei 72 ug (1:4)로 사용중이였는데, 새로운 들어온 선생님께서는 10ug도 많이 쓰는 거라고 하시면서 cell을 2.2x10^6cells(50~60% confluency) 깔고 dna:pei=1:3을 쓰신다고 하더라구요.. 교수님은 둘 중 맞는 조건을 쓰라고 하시는데 전자는 선생님 말씀대로 dna도 cell양도 너무 많은 것 같고 후자 조건을 참고하여 2.5x10^6 cells dna 7 ug 으로 사용중인데도 cell이 좀 많이 죽거나 48시간 transfection 후에도 50~70퍼 confluency밖에 안되더라구요.. Gfp나 형광으로 transfection 후 형광 현미경으로 확인하려고 하는데, 교수님께서 저희가 사용하는 현미경 카메라 감도가 너무 좋아서 의미가 없다고 하시더라구요.. 혹시 다들 transfection 조건 어떻게 하시는지 알 수 있을까요ㅜㅠ? 참고로 media change는 오히려 cell이 washing 중 쓸려나가는 것이 더 안좋을 것 같고 293T pei transfection 상에서는 체인지 안해도 괜찮다는 의견이 많아 진행하지 않고 있습니다..!
회원작성글 냥뮹  |  09.26
Q. sonication, Ni-NTA 첨부파일
Ni-NTA agarose (Qiagen)으로 protein purification하고 있는 대학원생입니다. 실험실에서 처음으로 재조합 후 단백질 발현을 하고 있는데 궁금한 점이 있어 올립니다. <protocol> 1. 200mL LB broth (AP100) OD600: 0.5-0.7 incubation 2. 0.1mM IPTG, 30℃, 150rpm, 6h induction 3. 원심분리 및 supernatant 제거 (-80℃ 보관) 4. 20mL lysis buffer (50mM NaH2PO4. 300mM NaCl, 10mM imidazole) 5. Lysozyme 1mg/mL incubate on ice for 30min 6. Sonication (60 Amp, 20kHz, 15 sec on/ 30 sec off, 30회) 7. 원심분리, supernatant 및 pellet 보관 8. Ni-NTA slurry 1mL 원심분리 및 supernatant 제거 9. 2mL lysis buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl) mix (inverting) 10. 원심분리 및 supernatant 제거 11. 20mL lysate와 Ni-NTA (equilibrated matrix) shaking (on ice, 60min, shaker) 12. lysate-Ni-NTA micture column으로 옮긴 후 bottom cap 제거하여 flow-thrugh 수집 13. 2.5mL washing buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole)로 2번 진행 및 수집 14. 0.5mL Elution buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazole)로 4번 진행 및 수집 15. BCA assay, SDS-PAGE <질문> 1) 50mL culture로 sonicaiton (60 Amp, 20kHz, 15 sec on/ 30 sec off, 20회) 조건으로 충분히 파쇄되고 약간 투명해지는게 확인됐습니다. 하지만 200mL culture는 기존 조건으로는 덜 투명해져서 sonication 횟수를 30회로 늘렸는데 더 좋은 방법이 있을까요? 횟수가 늘어나면 좋지 않다고 들어서요.. (현미경으로 관찰하면서 cell 파쇄됐는지 추가로 확인하고 있습니다.) 2) SDS-PAGE 결과, Elution 쪽에 목표 단백질인 약 30kDa 외에도 여러 band가 떴습니다. 이에 교수님은 Ni-NTA에 protein을 붙이는 과정에서 잘못된거 아니냐고 하셨는데 '20mL lysate와 Ni-NTA (equilibrated matrix) shaking (on ice, 60min, shaker)' 반응을 더 늘려야 할까요? 3) 약간 바보같은 질문일 수 있는데 혹시 protein genE size가 855bp인데 kDa으로 환산하면 30kDa이 맞을까요?.. 사이트랑 기존 계산법으로는 30kDa으로 나오는데 교수님은 70kDa이라고 하셔서요..
회원작성글 구릅  |  09.22
Q. Ni-NTA regeneration 이해가 안 가네요..
안녕하세요? 나름 Histag purification 고인물이라고 자처했는데,,, 아주 기초적인 부분에서 질문이 있어 남겨봅니다. 제 질문은 아래와 같습니다.   Elution 후 Ni와 결합한 Imidazole을 어떻게 제거하는가? PBS만으로 왜 제거 되는가?   저는 보통 Elution 후에 아예 Ni를 없애버리고, recharging 하는 방식을 썼었는데, 이게 Elution 후에 그냥 PBS로 washing만 하고 (Ni 유지), 다시 써도 되더라구요;;; 그렇다면 PBS washing이 Ni와 결합한 Imidazole을 고효율로 씻어내렸다는건데… 그게 가능한가요? Imidazole과 competition하는 내 histagged 단백질은, PBS washing에 끄떡없는데 말이죠? 혹시 소중한 지식 있으시면 나눔 부탁드립니다.   *참고) resin capacity는 거의 60 mg 이었고, 그거 다 잡고 PBS washing 후 flowthrough 30 mg정도 또 잡음. 그 외에도 엄청 많이 사용하는데 계속 됨;;
회원작성글 암세포  |  09.21
Q. HisPur Ni-NTA Purification시 Protein aggregation
안녕하세요, 저는 현재 A라는 eukaryotic protein을 E.coli에서 발현 중에 있습니다. A라는 protein을 insoluble하게 발현하여 activity가 있는 것을 확인했으며, A라는 Eukaryotic protein을 B라는 protein과 한 T7 promoter상에서 연결하여 발현 중에 있는데, 제가 원하는 site에서 보이지 않아 질문을 남겨봅니다. Vector는 pET28a(+)를 사용하여 N,C-ter 양쪽 모두 His-tag이 붙어있습니다. Induction condition은 16~37도 까지 Time 역시 바꿔가면서 Optimization을 모두 진행해보았는데 되질 않는 것 같습니다.  제가 Target으로 하는 예상 kDa는 62kDa인데, Induction후에 whole protein, pellet에는 예상 kDa부근에서 보이는데 Elution시에는 보이지 않고 30kDa부근에서 보입니다. Elution은 imidazole 250mM~300mM로 진행하였습니다. 따라서 protein이 insoluble하거나 His-tag 정제 시 문제가 있는 것 같아 보이는데, 해결이 되질 않습니다. 제가 놓친 부분이 있을까요? 참고로 loading 시 boiling도 하였고, 중간에 종결코돈도 없습니다. 아래 사진 첨부드립니다. 감사합니다.
회원작성글 agaz  |  09.20
Q. 카탈레이스 과산화수소 분해 실험
카탈레이스 과산화수소 분해 실험에서 과산화수소에 감자즙을 거름종이에 뭍혀서 실험하는 것보다 감자를 직접 썰어 넣어서 실험할 때가 떠오르는데 시간이 더 많이 걸리는 이유가 뭔가요? 감자를 직접 썰어서 실험을 하면 생기는 문제점이 감자 두께가 일정하게 썰리지 않아 변인 통제가 제대로 되지 않는다는 점 말고도 또 있나요?
회원작성글 수2대  |  09.17
Q. FPLC I.C를 마치고 단백질 활성도 질문입니다
원래 활성이 잘나와야하는 농도인데 Ion Exchange chromatography 후에 활성이 안나오네요.. 혹시 염을 확실히 제거 안하면 이런 경우가 있나요??
회원작성글 jyun1009  |  09.06
Q. FPLC I.C를 하는데
ion exchange chromatography에서 제 단백질이 1M NaCl에서 전부 안떨어지는 거 같은데요.. 혹시 1.5M로 NaCl 농도를 높여서 용출해도 상관없나요?
회원작성글 jyun1009  |  08.31
Q. Lysis buffer 조성관련해서 질문 드립니다.
안녕하세요. 대학원에서 재조합 단백질을 만들고 있는 대학원생입니다. 일단 재조합 단백질 발현에는 성공하였고, 추가적으로 Ni-NTA를 이용한 Affinity chromatography와 Refolding을  진행하려고 합니다.   그래서 Lysis buffer 레시피를 제작하고 있는데 조성은 다음과 같습니다. lysis Buffer 구성성분 20mM Tris-HCL 0.5M NaCl 5mM Imidazole 6M Guanidine hydrochloride 1mM 2-mercaptoethanol NaCl(ph 8.0 까지) 이 조성에다가 추가적으로 0.1% NP-40 (세포막 분해) 2mg Pepstatin (Protease inhibitor) 10mM Leupeptin (Protease inhibitor) 다음의 시약들을 추가하려고 합니다. 추가 하는 시약들을 넣어도 기능과 작용에 문제가 없을까요?  
회원작성글 kugamon  |  08.26
Q. 효소 배양에서 IPTG 넣고 induction을 진행해야하는데 IPTG양을 프로토콜의 10배를 넣어버렸습니다;;; 버려야할까요,....
프로토콜엔 100ml 배지 기준으로 IPTG 10 마이크로 리터를 넣어야 하는데 실수로 100 마이크로 리터를 넣어버렸습니다.... 버려야할까요,.... 아니면 살릴 수 있는 방법이 있을까요...?? IPTG는 효소 유도를 위해 넣는건데 과량으로 넣을 경우 cell 자체에 문제가 많이 생길까요...? 석, 박사님들 정말 도움이 절실합니다ㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 kkkumisara..  |  08.25
Q. fusion 단백질이 바뀌면 정제 조건도 바뀌나요?
안녕하세요, 단백질 정제 조건을 잡아가는 중인 대학원생입니다.   현재 정제해야되는 단백질은 다음과 같습니다. Integrin beta 1 - GFP - his tag Integrin beta 1 -mCherry - his tag Integrin beta 1 - His tag Target 단백질에 fusion 단백질만 바뀌는 형태인데, 위 단백질도 크기가 어느정도 있다보니까 위 세개를 각각 정제 조건을 잡아야하나요 아니면 하나만 잡아도 어느정도 일정하게 정제가 진행될까요? 정제 조건에 Detergent 종류, 농도, wash buffer/ Elution 의 imidazole 농도 등등이 있다보니 target이 바뀌면 각각 조건을 잡고 있긴 한데 빡세네요 ㅠㅠ
회원작성글 냥뮹  |  08.24
Q. Gelatin zymography 도와주세요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ band가 아에 없어요,,,
안녕하세요 zymography를 처음 해보는 석사생입니다ㅠㅠ 도움 받을 분이 없어서 혼자 진행해봤는데요,, Gelatin zymography를 통해서 MMP-9의 활성을 보려고 했는데 밴드가 아에 뜨지를 안습니다,, Sample을 prep은 먼저 6웰 플레이트에 A549 cell을 깔고 부착후 starvation하였고 후에 cell을 자극하고 시료를 처리하여 conditioned media를 모았습니다(starvation부터 모든 media는 SF media를 사용했구요) 이 샘플로 MCP-1 등의 ELISA 측정을 하였고 최종적으로 zymography를 수행했습니다,,!ㅠㅠ Zymography의 모든 젤과 시약은 invitrogen novex제품을 사용했는데요, Conditioned media를 LDS sample buffer(4x)로 4배 희석시켜준 후에 로딩하여 90V로 3-40분 정도 전기영동하였고 후에 renaturing buffer(1x)에 30분, developing buffer(1x)에 30분 상온에 둔 후 새로운 developing buffer로 교체하여 37도에서 overnight 했습니다. 후에 wash 3회 진행하였고 simplyblue safestain으로 1시간 gel 염색 후 d.w로 1시간 탈색하였습니다. 근데 아에 밴드가 뜨질 않아요,, 염색 후에도 밴드가 안보였으나 그대로 진행해봤는데,, 왜 안뜨는걸까요?,,, 도와주세요ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 sjsj3636  |  08.13
Q. Ni-NTA regeneration시 침전물의 정체가 뭘까요?
안녕하세요, 단백질 정제를 주로하는 대학원생입니다.   여느때와 마찬가지로 LC와 Ni column을 이용해 단백질 정제 중이었습니다만, Striping 및 Ni charging 이후 시간이 촉박하여 곧바로 Column equilibration을 진행하였습니다.   그런데 곧바로 A Buffer가 Injection되는 관을 따라서 침전물이 보였습니다.   Ni Solution과 A buffer가 혼합되며 침전물이 생성되는 것처럼 보였는데, 침전반응이 생길만한 것이 떠오르지 않습니다.   사용하는 buffer로는 Ni chargeing - 100mM NiCl2 Equilibration - 50mM potassioum phosphate, 100mM NaCl, 60mM Imidazole  pH7.5 사용합니다.   위 buffer들로 인하여 침전물이 생길 수 있습니까?   P.S. 100mM NiCl2를 Phosphate/NaCl 또는 Imidazole과 혼합시에는 별다른 침전물이 보이지 않습니다만, Phosphate/NaCl,/Imidazole buffer와 혼합시에는 침전물이 보이는군요.   실험이야 완충만 잘 해주면 상관없지만 침전물의 정체가 궁금하여 질문드립니다, 감사합니다.
회원작성글 Tedi  |  08.02
Q. Human protein atlas에는 안된다고 하지만 되는 경우도 있나요?
human protein atlas가 굉장히 세계적인 database?라고 알고있습니다. 제가 원하는 부위에서 해당 단백질의 발현을 연구하고자 하였는데 human protein atlas에서 IHC하였을 때 detect가 되지 않기 때문에 RNA level에서는 발현이 되지만 protein level에서는 발현되지 않는다고 나와있습니다. 하지만 최근 교수님께 문의드리니 같은 부위의 같은 protein에 대해 IHC하여 발현된 결과를 보여주셨는데 어디서 자료를 가져오신건지 모르겠지만 human protein atlas가 틀리기도 하나요?
회원작성글 별헤는밥  |  07.28
Q. His-tag / Ni-nta에서 EDTA 사용
어떤 protein의 ubiquitination을 확인하기 위한 실험을 진행중입니다. His-tagged된 ubiquitin을 transfection하고 배양 후 MG132 6시간 처리하고 lysis 하였습니다. 이후 Ni-nta 로 정제 후 western blot을 진행하는 방식입니다. 궁금한점이 제가 사용하는 lysis buffer 조성중 2mM의 EDTA가 들어가는데, chelate로 세포막을 약화시켜 lysis를 돕는다고 알고 있습니다. 그런데 EDTA가 Ni-nta 에서 ni 이온을 chelating하여 elution 시킨다고 하는데, 그렇게 되면 His-tag가 못붙을 것 같은데... 2mM의 EDTA가 정제에 큰 영향을 미칠수 있는건지 궁금합니다. 
회원작성글 Dozmal  |  07.26
Q. 혹시 정상세포 중에서 PDL1과 CD47을 모두 발현하는 세포가 있나요?
  안녕하세요, 항암제 공부하고 있습니다! 제 전공이 항암쪽이 아니지만 이쪽으로 진로를 정하고 싶어서 빡세게 공부하고 있습니다. pdl1 과 cd47이 암세포에서 많이 발현된다고 알고 있는데요, 혹시 정상 세포 중에서 두가지를 모두 발현하는 경우는 없나요? 관련 논문을 찾고 있는데 검색해도 잘 나오지 않고, 논문에서 언급되지 않아서 여쭤봅니다.    
회원작성글 짱쭁  |  07.24
Q. IHC 결과데이터에 negative marker 쓰는 이유
논문에 mouse brain에 IHC한 결과를 보는데요 DCX+GFAP+ 이렇게 보여주는건 알겠는데 KI67+NEUN- 이렇게 negative 발현을 표시해서 보여주는 이유가 뭘까요? 사진보면 NEUN 마커발현은 감소하고 이에대한 정량 그래프로는 KI67이 증가하는걸로 보이더라구요 궁금합니다.
회원작성글 him  |  07.21
Q. 단백질
요검사지에서 단백질을 검출 할 때   지시약이 단백질 아미노기 부분에서 수소이온을 잃고 색이 변화하는 원리를 이용한다고 하는데..  단백질 아미노기 부분에서 수소이온을 잃으면 왜 색이 변화하는지 궁금합니다.   또 적혈구를 검출 할 때에는  혈색소 가성 과산화효소 활성도를 활용하여 시험지 과산화수소수를 분해해 발생하는 산소로 색이 변화하는 원리를 이용한다는데   혈색소 가성 과산화효소가 무엇인지 그리고 과산화수소수를 분해해 발생하는 산소의 어떠한 특성 때문에 색을 변화시킬 수 있는지 궁금합니다.      
회원작성글 메디스은  |  07.16
Q. enzyme
요검사지의 포도당 검출원리에 대해 알아보고 있는데요   포도당 산화효소(Glucose oxidase)에 의해 포도당 산화→과산화 수소(H2O2) 발생→검사지에 있는 효소인 퍼옥시데이스(peroxidase)와 반응→발색제와 반응하여 초록색을 띰.   딱 이렇게 밖에 안나오는데.. 더 구체적으로 Glucose oxidase가 포도당을 산화시키는 과정? 원리나 퍼옥시데이스가 뭔지 그 반응식을 알고싶습니다.   
회원작성글 메디스은  |  07.16
Q. Trypsin 제거의 문제
안녕하세요,   우리 단백질이 트립신 처리 후    제거하는 공정에서 제대로 제거되지 않고,   일부가 단백질과 interaction을 하여 같이 용출되는 것 같습니다.   고수님들 중에, 이런 상황일 때,   트립신을 제거할 수 있는 효과적인 방법이 있을까요?   답변 부탁드립니다.
회원작성글 흑야화  |  07.15
Q. 1차 IEX capture 정제 질문입니다.
말그대로 1차로 capture의 목적으로 정제를 진행하는데,   1. isocratic (step) elution   2. gradient elution   고민입니다.   둘다 장 단점이 있으나, 여러분들이라면 1차엔 어떤 방법이 나을거라 생각하실까요?   1번을 택하면 amount는 높겠지만, impurity가 많을거고, 시간도 단축되고, 버퍼도 아낄테고...   2번은 resolution은 좋아져서 impurity가 1번에 비해 적을테지만, volume이 늘어나고, 시간이 길어지고, 버퍼 사용량이 많아서..   뭘해도 상관없는 시료입니다. 안정한 편이구요..   여러분들이라면, 몇 번을 선택하시고, 그 이유가 뭘까요!?   궁금합니다 
회원작성글 흑야화  |  07.14
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