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BioLab 박소정 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Pull-down Assays
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Q. 안녕하세요 Lowry method의 보완법을 고안하던 중 질문 드립니다.
안녕하세요. lowry assay를 진행 후 궁금한 점이 있어 질문드립니다.   제가 찾아본 바로는 bradford assay의 경우 낮은 pH에서 단백질을 펼쳐 정확한 흡광도를 얻으려 한다 확인했습니다.   그럼 Lowry assay를 진행할 때 단백질에 SDS를 활용하여 단백질을 펼친다면 더 정확한 결과가 나오는지 궁금하여 질문 남깁니다! 추가로 SDS-page를 보면 95~100도로 가열하는데, 만약 위의 방법을 쓴다면 가열하지 않고도 SDS를 이용해 단백질을 필 수 있는지, 또 가열을 하게 된다면 단백질 정량에 문제가 없는지 알고 싶습니다.  답변 주셔서 감사합니다.
회원작성글 점보아몬드  |  11.27
Q. bca assay 정량 계산 법 알려주세요 ㅠ
결과는 다 나왔는데 여기서 엑셀로 그래프 그리는 법을 모르겠어요 y=ax+b 이걸 어떻게 구하나요 ? 그리고 R^2은 어떻게 구하나요 ?
회원작성글 미미미미ㅣ미밈  |  11.21
Q. bca assay 정량 계산 법 알려주세요 ㅠ
결과는 다 나왔는데 여기서 엑셀로 그래프 그리는 법을 모르겠어요 y=ax+b 이걸 어떻게 구하나요 ? 그리고 R^2은 어떻게 구하나요 ?
회원작성글 미미미미ㅣ미밈  |  11.21
Q. streptavidin pull down 시 washing (?) 문제
지금까지 purify 한 protein 으로 in vitro streptavidin pull-down 실험을 잘 진행하고 있었는데, streptavidin agarose 제품을 기존에 쓰던 것에서 다른 것으로 바꾼 이후부터 non-specific band 가 뜹니다. 정확히는, biotin 이 들어있지 않은 sample 에서 protein 이 streptavidin 에 binding 했다는 결과가 나오고 있습니다. 단순히 washing 문제라고 하기에는 agarose 를 바꾸기 전까지만 해도 멀쩡히 실험 결과가 잘 나오던 터라, 다른 문제가 있나 싶어 질문 올립니다. 이전에 쓰던 제품은 Novagen 69203 이고, 현재 문제가 발생한 제품은 sigma s1638 입니다. 저로서는 이 둘이 큰 차이가 없다고 판단했고, 동일 protocol 을 사용했습니다. 조언 부탁드립니다.
회원작성글 움가  |  10.20
Q. 단백질 추출 및 정량 실험에서 쓸 단백질 종류 알려주세요
고등학생이구요 단백질 추출 및 정량 실험에서 무슨 단백질을 써야할지, 어떻게 구해야하는지 잘 모르겠습니다... 이왕이면 의약용으로 활용될 수 있는 단백질로 실험하고 싶은데 괜찮은 단백질 추천부탁드립니다!
회원작성글 ㅊ챙  |  09.15
Q. Signal Transduction 관련 질문 드립니다.
 안녕하세요, GPCR을 비롯한 Signaling transduction에 관심 있는 고등학생입니다.  이를 공부함에 있어 한게를 느껴 질문을 드리게 되었습니다.  이번에 Pepducin 관련 탐구를 진행하며 직접 컴퓨팅이 가능한지 의문이 들었습니다. 지금까지 문헌연구를 하며 이론적인 부분만을 다뤄왔지만, 이번에는 좀 심층적으로 들어가서 조절기전을 직접 실현해보고 싶다는 생각이 들었습니다. 혹시 singaling 과정을 직접 컴퓨터로 관찰할 수 있는 방법이 있을까요? 꼭 이것이 아니더라도, 단백질이나 효소간의 상호작용을 직접 모델링해볼 수 있는 방법이 궁금합니다.
회원작성글 jk_avery  |  08.25
Q. 단백질에 DTT처리 후 S-S결합이 재 결합된다면..
안녕하세요? 제가 실험을 진행하다가, 단백질의 S-S 결합을 끊는 DTT처리 후 원래대로라면 Iodoacetamide(요오드 아세트 아마이드)라는 시약을 처리 했어야 했는데 이 시약이 다 떨어져서 (제가 너무 어리석었습니다..)처리하지 못한 채 다시 이전 과정의 상태로 보관중인데요.. 요오드 아세트 아마이드는 단백질의 S-S결합이 해제된 펩타이드의 -SH기에 알킬기를 첨가하여 S-S결합의 재형성을 차단하기 위한 처리입니다. 혹시 이렇게되면 이 단백질 샘플은 버려야하는게 맞을까요..? DTT처리 후 그대로 두면 S-S기 결합이 재 형성된다고 알고있는데, 그러면 원래의 펩타이드 형태로 잘 돌아올 수 있을까요..? 단백질 샘플을 만드는데까지 시간소요가 꽤 걸려 이렇게 질문드립니다. 읽어주셔서 감사합니다. (말디토프/토프 MS분석 전처리 과정 중 발생한 일입니다..!!)
회원작성글 리플라믹  |  08.24
Q. HPLC retention time 및 wavelength 관련 질문
HPLC 관련 실험을 진행하고 있는 연구원 입니다. 관련 공부를 할려고 논문을 보다보니 식물 추출물 관련해서 두가지 다른 물질이 같은 retention time 을 가지고 다른 wavelength를 가집니다. 논문에서는 retention time과 wavelength를 기반으로 분류하였다고 되어 있는데 같은 부서의 연구원 분이 이 부분이 이상하다고 합니다. wavelength의 차이는 피크의 크기 차이만 생길 뿐이지 wavelength차이로는 다른 물질의 구분이 안되고 다른 물질의 구분은 retention time 만으로 한다고 합니다.  그리고 연구원 분의 말씀이 맞다면 retention time이 같은데 어떻게 다른 물질로 판단하는 기준이 뭔지 궁금합니다.  앞선 실험을 하셨던 여러 선배님들의 조언을 구합니다. 
회원작성글 막5  |  08.08
Q. GST-fusion protein에 관한 질문입니다.
GST를 붙이지 않은 단백질이 70kDa이고 GST를 붙였을때 96kDa라 한다면 GST-fusion protein을 SDS PAGE를 했을때 96kDa가 나오는게 맞는건가요?  GEL에는 96kDa가 아닌 70kDa가 나와서 헷갈리네요.. SDS PAGE를 하면서 GST tag가 떨어져 나올 수가 있나요? 아니면 다른 이유가 있을까요?  
회원작성글 바켐  |  06.17
Q. GST-pulldown 결과 질문입니다
안녕하세요 제가 이번에 학부 실험으로 단백질과의 결합을 실험하기 위해 GST-Pulldown assay를하고 SDS-PAGE를 했는데 결과 분석을 하는데에 있어서 헷갈리는게 있어서 질문 드립니다.  45kDa의 단백질1과 96kDa의 단백질2가 결합을 했다면, gel에 나오는 밴드는 두 단백질의 mass를 합한 141이 되어야하는건가요?  그게 아니라면 두 단백질이 결합을 했다는 사실은 어떻게 알 수 있는건가요?
회원작성글 바켐  |  06.17
Q. MG132 희석할때 결정생기는 현상
안녕하세요 RIPA Lysis buffer를 만들때 저희 랩에 aliqout되어있는 MG132 50mM를 10mM로 희석해서 사용하고 있습니다. 희석할때 열이 발생하면서 흰 결정이 많이 생기는데 결정이 생긴채로  Lysis buffer를 만들어도 되는지 궁금합니다.   아니면 lysis buffer를 만들기 전날정도에 미리 희석해서 두면 결정이 좀 녹을까요..?
회원작성글 뭉치쭈꾸  |  06.09
Q. IP 할 때 A/G BEAD 섞어서 쓰시나요 밑에 가라앉은 거만 쓰시나요?
냉장고에 보관해놓으면 두 층으로 분리되던데 섞어서 쓰시나요 밑에 가라앉은 거만 쓰시나요?  
회원작성글 리처드빱킨스  |  06.03
Q. in vitro pull-down assay 시 preclearing 필요성
purified protein 을 이용하여 IP 를 통한 in vitro pull-down assay 를 진행하고 있습니다. 여기서 cell lysate 를 이용한 IP 실험의 경우 preclearing 단계를 거쳐 non-specific binding protein 을 걸러내는 과정이 필요함은 알고 있는데요,   purified protein 을 사용하는 in vitro IP 를 진행할 때에도 prey protein 을 preclearing 후 이용해야하는지 궁금합니다.
회원작성글 움가  |  06.02
Q. bradford 단백질농도 ppm 질문드립니다.
이번에 bradford 실험을 했는데 흡광도는 562 / y= 0.503x + 0.115  BSA STD(mg/ml) 샘플은 희석하지 않고 10ul 넣었습니다  OD 0 = 0.1006667 0.25 = 0.2396667 0.5 = 0.386 1 =0.6256667 2= 1.1156667 샘플의 OD는 0.3027이 나왔습니다.  단백질 농도 ppm을 구하라고 하는데 어떻게 계산하는지 잘 모르겠네요.
회원작성글 1234578791..  |  06.01
Q. Western blot and IP
brain의 약물 효과를 보기 위해서 brain slice culture를 진행후 western blot을 진행중입니다. western blot으로 T-trkB IP로는 p-trkB를 보는데 결과가 잘 나오지 않아서요.. 혹시 다른분들은 어떻게 진행하시는지 알려주시면 감사하겠습니다.   
회원작성글 soosie  |  05.26
Q. E3 ubiquitin ligase에 의한 단백질 사이즈?
제목처럼 E3 ubiquitin ligase에 의해 단백질의 ubiquitination이 일어나면 size 변화가 어떤지요? Target 단백질로 IP 후 ubiquitin으로 western blot을 했을 때, E3 ubiquitination 된 정확한 사이즈를 어떻게 확인하는 지  알 수 있을까요? ubiquitination된 양에 따라 protein size가 달라진다고 봤는데, 그 중 E3 ligase에 의한 ubiquitination을 정확히 구분할 수 있나요?     
회원작성글 rkaehddldi  |  03.29
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