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BioLab 이은열 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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Q. 액체로 배송되는 WB항체에 글리세롤 넣어도 되나요?
1차항체를 구매했는데 버퍼 조성이 cryoprotectant 없이 그냥 PBS네요 제품 페이지에서는 단기보관 4도, 장기보관 -20도에서 하되, freeze-thaw를 피하라고만 적혀있고 글리세롤을 넣어도 되는지 적혀있지 않은데 그냥 최종농도 50%로 글리세롤 넣고 보관해도 될까요? 아님 1회분씩 aliquot 해서 -20도에 보관하는게 나을까요?   글리세롤을 넣으면 항체농도가 0.5mg/ml로 떨어질텐데 이 농도로도 보관에 문제가 없는지 모르겠습니다    
회원작성글 ckk  |  09.30
Q. ELISA와 WESTERN BLOT SAMPLING 조건이 꼭 같아야하나요?
안녕하세요!  저는 효능평가를 진행중인 석사생인데요! 제가 ELISA 데이터는 뽑았는데 기전쪽을 WESTERN BLOT을 수행해야돼서요! 제가 관련 논문들을 봤을때는 ELISA와 WESTERN에서 SAMPLING 조건이 다른 것을 꽤 봤는데요,,(WESTERN도 기전쪽과 염증분자들의 sampling 조건이 다른 논문들도 꽤 있었구요!) 그런데 저희 실험실에서는 완전히 같은 조건으로 상층액으로는 ELISA, Pellet으로는 WESTERN을 보시더라고요, 그리고 한 분은 elisa와 western의 sampling 조건은 무조건 똑같아야된다고 조작이라고 하시는데,, 정말 꼭 그런건가요? 그렇다면 제가 본 논문들은 다 조작인가요?,,,,,, ELISA 데이터는 Sampling 을 4시간 자극 후 물질처리를 24시간 해주었습니다. 그런데 phospho-nf-kb를 보려고 같은 조건의 pellet으로 western을 수행했을때 전혀 나오지 않더라구요,, 그래서 이번에 조건을 다시 잡아보려고 물질을 24시간 pre-treat한 후에, 자극을 30min, 1hr, 2hr, 4hr, 6hr을 하여 pellet을 모아볼 예정인데 너무 ELISA의 조건과는 달라지는 것 같아서 걱정이 돼서 여쭤봅니다,, ELISA와 WESTERN BLOT Sampling 조건이 무조건 똑같아야되나요? 그리고 달라도 된다고 했을때, 저처럼 너무 달라지면 논문쓸 때 곤란할까요? 걱정됩니다ㅠㅠ 전문가분들 답글 기다리겠습니다ㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 sjsj3636  |  09.29
Q. b-mercapto 가 protein cleavage 할수있나요?
b-mer은 polymer 의 s-s bonds를 끊는 것으로 알고있습니다.  제 WB실험중 단백질의 band의 size가 원하는 size보다좀더 낮게 나왔습니다.  (glycosylation을 고려해도 훨씬 낮게나왔습니다.)  단백질 4차구조에서 disulfide 를 끊어 monomer상태의 단백질을 b-mer가 더 cleavage해서 size가 낮게나온걸까요...? 처리 농도는 회사 protocol대로 처리하였습니다
회원작성글 오우  |  09.28
Q. Protein sample boiling 1시간
100도에서 10분 boiling 한다는걸 다른 실험하다 깜빡하고 1시간정도 두었어요 ㅜ 스핀다운 해보니까 증발하거나 그런것 같진 않은데 웨스턴 가능할까요?
회원작성글 2밍  |  09.27
Q. western blot reprobing 관련 membrane
western blot membrane을 교체하려고 고민중이라  관련된 질문 남기려고 합니다!   기존 PVDF를 사용하고 있었는데 strip이 전혀 되지 않아서 한번만 사용 후 매번transfer까지의 과정을 다시 진행했는데요 !   PVDF의 경우 Reprobing이라는 과정을 따로 진행하는 것으로 보이는데 이 과정이 Stripping과는 별개인가요 ?    현재 NC로 변경하여 stripping을 하여 사용하려고 찾아보던 중이였는데 reprobing 과 stripping의 차이점을 모르겠어서요 ㅠ  답변부탁드립니다. 
회원작성글 랄리  |  09.26
Q. western detection 문제 첨부파일
<사진첨부>   웨스턴 detection을 하였는데 왼쪽부분은 밝고 오른쪽 부분은 검게 배경이 나왔습니다... 혹시 이거 왜 그런걸까요ㅜㅜ 카메라 문젠가도 생각해 봤는데 같은 카메라로 다른 학생이 찍을 땐 안 그러는데 제것만 이렇게 뜨네요,,    그리고 전체적인 background도 까매서 밴드가 잘 안보이는데 이건 왜 그런걸까요,,,,,,, loading control이라서 잘 보여야 정상인데 ㅜㅜ
회원작성글 쿵쿠따리쿵쿠따  |  09.26
Q. Lugen sci 사의 sensi-Q2000 chemidoc 사용하시는 분 계신가요
안녕하세요 현재 western blot을 처음 해보는 초보 대학원생입니다. 저희 실험실에 Lugen sci 사의 sensi-Q2000 chemidoc 기기가 있어 western blot의 band 확인을 하려고 합니다.  기존에 저희 실험실에서는 저 기기를 DNA 전기영동 이미지를 찍는데에만 사용했어서 western blot 이미지를 찍을 수 있는 설정 및 조건을 전혀 모르겠습니다 .. 업체에서는 더이상 생산되지 않는 제품이라 담당자가 없다고 하시구요 혹시 사용하시는 연구실 있으시면 이미지 촬영 설정 및 조건에 대해 알려주실수 있으실까요..? 부탁드립니다 ㅠㅠ
회원작성글 ㅇㅎㅇㅎ  |  09.26
Q. western blot band shape에 대해서 여쭤볼게 있습니다
안녕하세요  western blot을 진행했는데 detect 후에 band를 보니 band가 가운데가 비어 두겹처럼 나와있더라구요 ㅜㅠㅜㅠ   loading할때 intensity가 너무 높아서 빨리내리다보니 band 가운데가 비어있게 된걸까요 ? protei은 30ug, gel은 fastcast kit 사용했습니다    western 초보라 아직 data 해석에 미숙해서요 ㅠㅜ 아시는분 답변 부탁드립니다 ...    band 라인은 하나입니다 ,..!!    +)다른 gel의 band는 휘어지게 나왔는데 이 이유도 아실까요 ??  같은 gel이여도 휘어진 band랑 안휘어진 band랑 공존합니다 ㅜㅜ     >위에 첨부한 두 사진들의 결과는 모든과정을 동일하게 동시에 진행했으며, Ab만 다른아이들입니다 ㅜㅜ  
회원작성글 뚜리  |  09.24
Q. BCA assay 이거 맞을까요?
안녕하세요  BCA assay를 하기 위해 준비중입니다. BCA A 와 BCA B를 49:1의 비율이라고 할때 BCA A가 이 제품이 맞는지 확인부탁드립니다.  
회원작성글 AD석사생  |  09.22
Q. WB/ 1,2차 antibody
안녕하세요  WB 1차 2차 안티바디에 대해 아직 정확한 개념이 잡히지 않아서 글을 남기게 되었습니다. WB를 actin으로 단백질을 확인하고자 합니다.   1차 안티바디와 2차 안티바디를 사용하려고 하는데 이렇게 사용을 하면 되는지 확인부탁드립니다.   1차 안티바디는 rabbit 이며, 2차안티바디는 HRP rabbit입니다.   윗선배가 없는 상황이라 너무 기초적인부분을 올려서 죄송합니다. 이전 교수님께서 설명해주시기로는 HRP가 발광을 한다고 하셨던걸로 기억을 합니다. 그래서 2차 안티바디는 HRP가 적혀있는걸 사용해야 dectetion을 했을 때 band가 나온다고 하신걸로 기억합니다.    1차 안티바디     2차 안티바디
회원작성글 AD석사생  |  09.21
Q. transfer 후에 marker는 사라지고 portein은 확인되는 현상 첨부파일
안녕하세요, 대학원 석사 과정 중에 있는 학생입니다. 제목에서처럼 western blot 진행 과정에서 transfer 전에는 marker가 잘 확인 되었고, transfer 후에 gel에는 없지만 membrane에서 marker가 확인되지 않아(정확히는 매우 연하게, 없다싶을 정도로), transfer가 잘 되지 않았다고 판단했습니다. 그래도 혹시 몰라 antibody를 붙여 확인해보았는데, beta-actin 기준 protein 밴드가 뚜렷하게 나타나서... 혹시 transfer 후에 marker는 사라졌으나 protein은 잘 옮겨가는 경우도 있나요? 제가 그 membrane과 똑같은 조건으로 다른 membrane도 동시에 실험 진행 중이었는데, 다른 membrane은 marker가 잘 확인 되었고, protein도 잘 나타났습니다. transfer buffer는 똑같은 것을 사용했기 때문에 문제가 없다고 생각하고, 한 기기에서 두 개의 transfer tank를 연결했기 때문에 기기의 문제라고 보기도 어렵다고 생각합니다. 전압은 100V, 100분으로 설정하였고, gel 농도는 10%입니다. 사진은 beta-actin이고, marker가 확인 된 것과 안 된 것 입니다.(동시에 진행된 membrane입니다.) 혹시 비슷한 경험과 원인, 조언 주시면 감사하겠습니다ㅜㅜ
회원작성글 shinhwa  |  09.20
Q. SDS page 밴드 번짐? 첨부파일
안녕하세요  SDS-PAGE실험 중 궁금한게 생겨서 질문남깁니다.  이전에는 이런경우가 거의 없었는데 최근에 젤 러닝 후 염색하면 항상 레인 밖으로 번지듯이 내려오는게 보여서요  혹시 원인이 뭔지 아시는 분 있으신가요? 그리고 저렇게 내려온 경우 western blot 과정에서 문제가 생길 수 있나요?
회원작성글 ㅇㅎㅇㅎ  |  09.19
Q. protein induction이란게 뭔지 잘 이해가 안됩니다..
cell에 IL-1b or LPS 처리 후 con에 비해 변화한 western blot band를 두고 선배들이 induction이 잘 된 것 같다고 설명하더라구요. induction과 expression의 차이가 있나요? cell에 IL-1b나 LPS를 처리하면 염증성 사이토카인등이 분비될 것이고.. 그럼 염증 마커들을 확인했을때 마커 두께가 두꺼워 질 것이고..그렇다면 발현이 증가한 것 아닌가요..? induction이라는게 정확히 이러한 실험에서 어떤 상황을 이야기하는 것일까요...?  
회원작성글 gamja  |  09.18
Q. westernblot 트랜스퍼 시 두 멤브레인의 경향성이 다르게 나와요
wet 트랜스퍼 할때 pvdf 카세트가 두개 들어가잖아요? 트랜스퍼 돌릴때 같은 샘플로 1번, 2번 pvdf 카세트에 트랜스퍼 한 후, 2개 멤브레인에 항체 반응을 하면 1번 2번 멤브레인의 밴드가 경향성이 같게 나오지를 않네요. 이런 경험 하신분 계실지, 어떻게 해결하셨는지 아시는분 혹시 있으신가요? 
회원작성글 AGCT  |  09.15
Q. Heat shock
Ip 하고 heatshock 5분 정도 하려고 했는데 15분정도 방치해버렸습니다ㅠ 샘플이 아까워서 wb까지 진행했는데 flag은 나오는데 다른 항체에서는 안보이네여,, 원인을 찾고있는데 heat shock 오래한게 크게 문제가 될까요..?
회원작성글 바닷가  |  09.14
Q. 전기영동 관련 질문드립니다.
안녕하세요.   Cell에서 천연물의 활성을 확인하기 위하여 웨스턴블롯을 진행하고 있습니다.   실험실의 전기영동 프로토콜대로 실험을 진행하고 있으며 결과는 만족스럽게 얻고 있습니다. 평범하게 실험하던 도중 궁금하던게 떠올라서 질문드립니다.   프로토콜에 따르면 겔을 만들고 샘플을 로딩할때 양쪽 끝에 샘플버퍼(실험실에선 2x laemmli sample buffer 사용함)을 로딩하고, 양쪽 끝에서 두번째에는 마커를 로딩하고 있습니다.   혹시 양쪽 끝에 샘플버퍼를 로딩하는 이유를 질문드려도 괜찮을까요??   감사합니다.   항상 궁금하던 질문이어서 계속 찾아본 결과.. 결국 못찾았습니다.  
회원작성글 생약학  |  09.13
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