안녕하세요    WB 할떄 1차 , 2차 안티바디 구분하는 법이 어렵습니다. ㅜㅜ   항체, 항원에 대한 개념과 1차 2차에 대한 개념이 있다고 하기엔 부족하고 없다고 하기엔 있는거 같습니다. 1차 항체 : A라는 동물에 target 단백질을 주사해서 만든 Ab   - 2차 항체 : B라는 동물에 A라는 동물의 IgG를 주사해서 만든 IgG       어떤 원리로 어떤 방법으로 1차 2차를 붙히는지는 알겠지만  예를 들어 actin을 확인하고자 하면 1차 안티를 anti- actin antibody in Rabbit 이라고 하면 2차 항체로 Rabbit lgG (HRB) 를 쓰는데  그러면 1차에 Rabbit를 쓰고 2차를 goat를 쓰면 안되는건가요??   1차를 rabbit을 쓰면 2차도 rabbit을 써야하는지 아니면 goat를써도 되는건지에 대한 개념을 못잡겠어요 ㅜㅜ  매번 누구한테 이렇게 쓰면 되냐고 물어볼수도 없고 공부할수 있는 좋은 방법이 없을까요?

필요한 1차 항체를 몇가지 찾다가   source에 rabbit과 rabbit IgG 가 구분되어서 적혀 있던데,   둘 다 2차 antibody를 rabbit으로 사용하면 되는건가요?   아니면 rabbit IgG에 맞는 2차 antibody가 있는건가요? 구분해서 붙여야 하나요?

phosphorylated protein 웨스턴 블럿시 nonspecific band가 찾고자하는 band를 구분할 수 없을만큼 많이 생기면 어떻게 해결해야하나요..? phospho protein이라 skim milk를 사용할 수 없어서 5% BSA로 blocking, 항체처리를 하고 있는데 blocking 시간을 늘려보기도 하고 항체 농도를 바꿔봐도 진전이 없습니다ㅠ

안녕하세요   p-JNK를 보고 JNK를 확인하려니 JNK1 안티바디와 JNK2 안티바디가 각각 있네요  이럴땐 어떤걸로 토탈을 확인해야할까요?    고맙습니다

안녕하세요. 실험실 초보 석사 1학기 대학원생입니다.  현재 실험실에서 western blot실험을 할 때 a-tubulin을 housekeeping으로 사용하고 있는데 일정하게 나오지 않고 있습니다.  모든 protocol을 익숙히 하고 실험을 진행하고 있는데도 불과하고 일정하게 나오지 않는데 아무래도 피펫팅이 큰 문제로 되고 있는것 같습니다. 일정하게 나오지 않게 되는 문제초래점 몇가지 제시해 주시길 바랍니다.   Ps. BCA assay로 protein정량을 진행하고 있는데 R^2=0.98~0.99로 나오고 있습니다. 실험을 오래 해오신 선배님들의 조언을 바랍니다~~^^

안녕하세요?? western blot에 어려움을 겪고 있는 석사생입니다~ 저는 melan A cell protein  30 μg 사용합니다.  SDS gel을 runnning 하고 membrane에 transfer를 하는데요~ transfer하고 난 뒤 폰슈 염색을 하면 (사진처럼) 자꾸만 깨끗하게 transfer 되지가 않아서요ㅠㅠ transfer는 2.5 A 25V에서 30 분정도 실시하구요.  처음 해봤는데 뭐가 문제인지 모르겠습니다. ㅠㅠ

고분자량을 쪼개서 저분자량 단백질 (5kDa 내외) 로 만드는 실험을 하고 있는데요. HPLC를 처음 찾아봐서 질문드려요 ㅠ   사이즈를 계속 확인하면서 테스트 해야할 것 같은데 SDS PAGE는 세팅도 안되어있고 실험이 오래걸릴 것 같아서..   HPLC는 의뢰 맡기려고 하는데 단백질 사이즈 확인할 때 SDS PAGE를 HPLC로 대체할 수 있을까요? 사이즈마커로 분자량을 알고있는 시료 (예로 10kDa, 5kDa 갖는 것들..)랑 같이 걸어서 사이즈를 유추한 데이터를 논문용으로 SDS PAGE 대체해서 올릴까 생각하는데 가능한 방법 맞을까요..   감사합니다!

Ni-NTA 친화 크로마토그래피를 통해 정제한 his-tag가 달린 단백질을 sds-page를 한 결과입니다. 크로마토그래피를 할때 elution을 다섯 번 했고, 각각 다른 tube에 elution 했습니다. 왼쪽부터 순서대로 elution 1, elution 2, elution 3, elution 5, elution 4  입니다.   1) 왜 elution 횟수가 늘어날수록 정제한 elution의 진하기가 옅어지는지 궁금합니다. 2) 네 번째에 있는 elution 5의 결과는 왜 다른 elution들에 비해 깨끗하게 결과가 나오지 않았는지 알고 싶습니다.

sds page를 하고 질문이 있어 질문 올립니다.   1) Ni-NTA 친화 크로마토그래피로 정제해 얻어낸  elution(대장균의 his-tag 단백질)에서 왜 75kDa가 가장 많이 나온건지 모르겠습니다. 그저 이 단백질에 75kDa가 많이 들어있어서 그런건가요? 2) washing을 두 번 하고 각 washing에서 얻어낸 wash I, wash II에서는 대략 25kDa가 가장 많이 정제된 것을 확인할 수 있었는데 이 wash는 무슨 이유로 elution과 다른 결과를 보이는 건가요? 3) sds page의 결과로 나타난 밴드의 해석은 어떻게 하는 건가요?  (예를 들어, 밴드의 길이, 밴드의 진하기 등)   질문이 애매해 죄송합니다. 그래도 답변 달아주신다면 정말 감사하겠습니다!

웨스턴을 진행해서 봐야할 타겟 단백질이 Caspase-1 이라는 protein인데요. 이 protein의 size를 알고 싶어서 cell signalling이라는 사이트에 들어가서 caspase-1을 검색해보니까 MW 20, 22 이렇게 나오는데 이게 이 protein의 size 범위가 20~22라는 건가요? 그리고 IL-1β 같은 경우는 17,31 이렇게 나오는데 이런 경우에는 왤케 레인지가 큰 건가요? 단백질의 size가 정해진 게 아닌건가요??

암세포에 약물을 처리하고 p-Jnk의 발현을 확인하는 실험을 하는 중인데, 메커니즘은 약물이 ER stress를 일으켜 Jnk를 인산화시켜 CHOP의 발현량이 증가하여 세포를 사멸한다고 알고 있는데, p-Jnk가 p46, p54라고 jnk1, jnk2가 있더라구요..  p54는 시간별로 증가하는데 p46은 점차 감소하는 양상으로 확인이 되었는데  p46과 p54의 각각의 차이와 관계에 대해서 알고 싶습니다.. 제가 검색해서 봤을 때는 설명에 대해 이해를 잘 하지 못하겠어서 질문을 올립니다

50~100kDa짜리 단백질을 효소로 펩티드 단위로 쪼개서 약 5kDa정도로 만들고 있습니다.   5kDa 이하가 될 수도 있는데 제가 원하는 사이즈는 5~10kDa 여서 사이즈 분포를 확인하면서 최적 조건을 찾으려 하는데  사이즈가 작아서 SDS PAGE로는 보기가 어려울 것 같아서..   분자량 분포를 확인할 수 있는 다른 방법은 뭐가 있을까요?ㅠㅠ 감사합니다!

학부인턴생입니다 Western blot하다가 이게 맞는 내용인지, 의문점을 여쭤봅니다   SDS-PAGE loading하기 전이나 SDS-PAGE 할 때는 약간의 열이 가해지고   그 외 과정(특히 Transfer)은 차갑게 ice에 넣어놓거나 Transfer할 때는 tank안에 ice pack과 스티로폼에 ice를 채워넣어 sample들을 낮은 온도에 유지했습니다   sample 준비, loading 중에서는 열+ b-mercaptoethanol + sds에 의해 단백질이 Transfer 외 과정보다 상대적 고온에 대해 안정되게 만들고, 단백질간의 새로운 결합을 막고 이온화되어 있는 채로, 선형인 채로 loading하기 위해 열이 있는 환경에서 loading하였고 Transfer의 경우 이미 젤에 loading이 되었고 transfer하는 과정에서 높은 온도에서 안정화시키는 물질들이 없어졌기 때문에 낮은 온도에서 하는 것이다   라고 이해를 했습니다 이게 맞을까요?   아무리 생각해봐도 이해가 잘 안됩니다 SDS-PAGE는 온도가 높은 상태, Transfer할 때는 온도가 낮은 상태인 이유는 무엇인가요?   그게 아니라면 맞는 지식 가르쳐주시면 감사하겠습니다

blocking 1시간 이후에 TBST 워시를 잠깐 한다는 것을 잊어버려서 2시간동안 워시를 했네요.. 그래서 다시 blocking을 30분 정도 하고 간단히 워시 후 항체 붙였는데 혹시 문제가 있을까요..?

stacking gel buffer를 사용하기 몇시간 전에 미리 만들어 놓는데,  이 때 temed는 사용하기 직전에 넣는데  혹시 APS도 마찬가지로 사용하기 직전에 넣어야 할까요? 

웨스턴 시 타겟 단백질과, 하우스키핑진을 꼭 같은 필름에 현상해야하나요? 타겟 단백질의 발현이 매우 낮은 경우 길게 exposure해야하는데 그럼 하우스 키핑 단백질이 너무 두껍게 나오는 경우가 있습니다. 그래서 하우스 키핑 단백질을 다른 필름으로 확인한 뒤 타겟은 더 길게 exposure해서 타겟단백질/하우스키핑 단백질 로 계산해서 control cell과 exp cell을 비교하는데 이렇게 하면 잘못 된건가요?