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BioLab 박소정 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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Q. westernblot membrane이 왜이럴까요? ㅠㅠㅠㅠ제발도와주세여....
안녕하세요 westernblot 하는데 사진처럼 membrane이 자꾸 어둡게 나와서 뭐가 문제인지 모르겠습니다 ㅠ b-actin은 계속 잘나오는데 나머지Ab들이 자꾸 안나옵니다. 원래 blocking 시간은 1시간, RT 했는데 이번엔 2시간 했고, 1차Ab 농도도 1:1000했는데 1:800으로 늘렸구요, 4도씨 콜드룸에서 O/N했습니다.  워싱은 TBST이용하는데, 짧게 자주 교체해주라고 하시는 분이 계셔서 원래는 10분씩 3회 하는데 8분씩 5회 했고, rpm 도 더 세게 늘렸습니다.  2nd Ab는 원래 1:5000에서 1:10000으로 낮췄습니다. 아, 2nd Ab 하기 전에 re-blocking이 불필요한 detection 없애준다고 해서 10분정도 blocking 했구요. 그러고 나서 8분 5회 워싱 후 LAS 촬영했습니다. 도대체 뭐가 문제인지 모르겠습니다. 심지어.. 이번엔 IL-10이 그 전에는 membrane어둡고 멀티밴드가 나왔는데,  이번에 촬영해보니 군데군데 구멍도 나있고 두번째 membrane에는 그을린 것 같이 일부가 없어져서 나왔더군요... 사진마다 2개의 membrane 중 위의 것끼리는 같은 membrane이고 아래의 것 끼리는 같은 membrane입니다만, 다른 membrane은 다 괜찮은데 IL10은 왜 저런 구멍이 난걸까요 ㅜ membrane 어두운것, 멀티밴드, IL10의 밴드 손상 제발 도와주세요 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 
회원작성글 dbkorea  |  12.03
Q. western blot 시 멤브레인 전체가 흐릿하게 나옵니다..
안녕하세요, western blot 실험을 갓 배워서 이번이 세번째 실험인 초보입니다.. 아래 사진은 맨 처음 실험했을 당시 b-actin에 대한 결과인데, total protein의 농도가 40ug가 되도록 loading해주었습니다. 그런데 밴드가 일정하게 뜨지 않고 진하기가 다 다르게 뜨더라구요. 이 부분은 제가 초보라 정량하는 과정에서 실수가 있었을 수도 있겠구나 생각했습니다. 적어도 이 때는 membrane이 타지도 않았고, reference gene의 expression 정도가 다르게 나타날지언정 background도 뜨지 않아서 정량을 다시 잘 해서 재실험하면 잘 나오지 않을까 막연하게 생각했었습니다. 그런데 2, 3번째 실험을 했을 때는 아래 사진처럼 밴드가 전체적으로 너무 흐릿하게 나오더라구요.. total protein 농도는 똑같이 40ug로 맞춰주었습니다. 넣어주는 protien의 양 자체가 너무 작아서 그런건가 싶어서 찾아보았는데, 다른건 몰라도 b-actin의 경우 보통 50ug 정도면 충분히 잘 나올만한 양이라고 하는것 같아서요..ㅠㅠ 그리고 첫번째 실험했을 때랑 농도도 같은데 왜 이렇게 흐리게 나오는지 모르겠어요. Background도 심한것 같고.. 아 blocking은 3% BSA로 상온에서 한시간 해주었습니다.     제 스스로 조금 걸리는 부분은 Running buffer & transfer buffer를 재사용한 것인데, 제가 실험을 처음 배웠을 때 running buffer와 transfer buffer를 5번까지 재상용한다고 배워서 그렇게 진행했었습니다. 위의 사진은 두 buffer 모두 딱 5번째 재사용한 상태이구요. 그런데 결과가 잘 안나와 찾아보니 buffer를 재사용하지 말라는 말도 많더라구요.. 그리고 1st, 2nd Ab도 재사용하였습니다. 제가 배울때 6개월이 지나지 않은 상황에서는 닳아없어질때까지 써도 된다고 배워서.. 거의 8번정도 재사용한 상황입니다.  그 외에 실험 조건을 적어보면 SDS-PAGE (Running buffer 재사용/5번) - 8% gel - 70V, 0.2A, 300W로 전기영동 15분 (전압 고정) - 100V, 0.2A, 300W로 전기영동 약 한시간 (전압 고정) Transfer (Transfer buffer 재사용/5번) - 얼음 위에서 진행 - 110V, 0.25A, 200W로 2시간 20분 Blocking - 3% BSA로 상온에서 한시간 항체 붙이기& wash - 유리판 위에 membrane 올려두고 1st Ab (1: 1000 희석) 뿌려준 후 먼지 들어가지 않도록 덮어주고 4도에서 overnight - TBST로 5분간 3번 wash - 2차항체 (1:5000 희석) 뿌려준 후 상온에서 한시간 rocking - TBST로 10분간 3번 wash   ECL solution A, B 1:1로 섞어준 후 뿌려주고, 킴텍으로 충분히 제거 후 필름으로 덮어주고 케미닥 찍음   중간중간 조금 생략한 과정도 있지만 대략적으로 이렇게 진행하였습니다. 긴 글 읽어주셔서 감사하고, 많은 지도 부탁드립니다.ㅠㅠ 감사합니다!
회원작성글 천행  |  12.02
Q. western blot 실허 관련 질문 있습니다 !
학부생인데 1차항체 2차항체 붙이는 과정이 잘 이해가 안가서 질문 드립니다 ㅠㅠ    1차항체를 처리- washing - 2차항체 처리 하는 과정에서 중간 washing 과정 관련해 의문이 들었는데요. 2차항체가 1차항체를 확인하기 위해 붙이는 것으로 알고있는데 washing 과정을 거치게되면 1차항체가 제거될텐데 왜 washing을 하는건가요??
회원작성글 대하권진학예정  |  12.01
Q. western house keeping protein
galectin-1이라는 단백질을 transfection 시킨 후, single cell cloning을 거쳐 여러개의 clone을 얻어 gal-1 발현률을 비교해보고 있는데 house keeping 단백질이 계속 흔들립니다.   b-actin도 써보고 a-tublin도 써보는데,  둘다, gal-1이 많이 높게 발현되는 clone에서 그 발현양이 매우 낮습니다.   일단, QPCR로 확인을 하긴 할건데 이 clone들이 다른 유전자가 KO 된 것에 OE를 시킨 것이라 두 유전자의 영향이 있을 수는 있을 것 같긴한데 GAPDH를 써서 한 번 더 해봐야하나  고민 중입니다   comment를 부탁드립니다.
회원작성글 새슬  |  11.30
Q. Western blot band 질문 첨부파일
RAW 264.7 cell에 단백질로 p-p65등을 western blot으로 보려고 합니다. 근데 화면 지지직 거리는 그런 화면같이 나오거나 crop 밴드 형태만 나오고 band가 안나옵니다. 뭐가 문제인지 모르겠어요. 캐미닥을 쓰고 있고 blocking solution은 Ez blockchmi 쓰고 있고 transfer도 blocking과 같은 브랜드 제품 쓰고 있습니다 고수님들 도와주세요ㅠ 오늘안으로 알아야 되서요ㅠㅠ 급합니다
회원작성글 ono  |  11.30
Q. SDS-PAGE gel 유리판
SDS-PAGE gel 만들때 뒤의 short plate는 철로 된것이고, 앞은 유리로 된거 사용하는데 강하게 나사로 고정하면 유리가 깨지고 약하게 고정하면 젤이 굳기전에 흘러서 만들기가 참 어렵네요. 유리판을 써야하는 이유가 있나요? 플라스틱판이나 아크릴판을 적정크기로 잘라서 유리판대신 사용해서 젤 런하면 안되나요? 플라스틱판은 원래 없는건가요? 감사합니다.
회원작성글 BBlue  |  11.30
Q. western할때 membrane이 b-actin은 잘 나오는데 나머진 다 너무 어둡습니다 ㅠ 첨부파일
첨부한 사진처럼 b-actin은 그래도 membrane이 괜찮은데 나머지 ab들은 모두 il-10처럼 membrane이 어둡습니다. 1차 ab는 4도씨 12hr 이상 붙였고 그 후에 워싱 10분x3회 2nd ab 1hr 30min 워싱 10분x3회 그 후에 las 촬영했습니다. 대학원생때 이렇게 줄곧 해온 방법이라 왜 이러는지 모르겠습니다. 지금은 las 촬영때문에 ECL 처리 했던 것을 TBST에 넣어두고 있는데 워싱을 좀 더 하면 될까요? ㅠㅠ
회원작성글 dbkorea  |  11.29
Q. semi-dry transfer
Bio-rad 제품 semi-dry transfer 기계를 사용하는데, 저는 여기서 0.45 uM의 PVDF를 씁니다. 혹시 mini와 midi의 차이점이 정확히 뭔지 궁금합니다 ㅜㅜ  저는 midi로 걸었는데 아무 이상 없이 잘 사용해왔는데 mini로 transfer을 하는것이랑 차이점이 정확히 무엇인지 궁금합니다 
회원작성글 오이가싫어  |  11.28
Q. western할때 transfer 이 두판밖에 안됩니다 ㅠ
우선 gel은 4개 만들어놓으려고 하는데 러닝 기계는 한번에 4개가 돼서 가능하면 러닝 4개 하고  트랜스퍼를 2개씩 나눠서 하는 방법은 없을까요?  
회원작성글 dbkorea  |  11.28
Q. 항체 species reactivity
1차 항체를 샀는데 reactivity가 human입니다. 그럼 mouse protein에는 아예 붙지 않는건가요?
회원작성글 별헤는밥  |  11.28
Q. Western blot blocking
안녕하세요 4학년 학부생입니다.. Western blot 실험 중인데 트랜스퍼 완료 후 워시까지 진행하였습니다.. 그런데..!!!! Skinmilk로 블락킹을 안하고 바로 1차 안티바디를 붙여서 상온에서 2시간 진행중에 있습니다… 그대로 진행해도 괜찮을까요..? 아니면 wash 하고 다시 블락킹 먼저 할까요..? ㅠㅠ
회원작성글 Dvs  |  11.25
Q. SDS-PAGE gel 유리파손
SDS-PAGE gel을 만들어 굳었는데 앞유리판 한쪽 모서리에 세로로 금이 갔습니다 샘플 로딩하는 well부분은 괜찮고 well옆 세로방향으로모서리에 금이 가버렸네요. 이 젤 샘플로딩해서  달려도 괜찮아요?
회원작성글 BBlue  |  11.23
Q. WB GST band
GST에서는 band가 검출되지 않고 actin에서만 band가 검출되었습니다. 아마 gst가 제대로 붙지 않았거나 단백질의 양이 많아서 그런거같은데 여기서 GST 쪽의 결과가 왜저렇게 어두운건가요? 또한 제가 생각한 이유 외에 GST가 검출되지 않은 이유가 있을까요?   시간내주셔서 감사합니다
회원작성글 물방울주먹  |  11.23
Q. western blot 실험 GST band가 안 나온 이유
제가 아직 공부 중인 편입생이라 너무 헷갈려서 질문 남겨봅니다.. 학교에서 western blot 실험을 진행했습니다. 근데 나온 결과를 보니 beta-actin band는 잘 나왔는데, GST band는 나오지 않았습니다. 제가 생각하기론 단백질과 bead가 binding이 되지 않았거나 2차 항체가 붙지 않아서 보이지 않는 걸까요..? GST band가 계속 나오지 않네요ㅠㅠ GST band가 나오게 하기 위해서는 어떻게 해야하는지 궁금합니다...실험 처음 과정에서 부터 문제가 있었던 것일까요?
회원작성글 뚱때지  |  11.23
Q. cell harvest
WB sample 만드는 과정에서 cell을 harvest 하기 전 pbs 워싱 단계에서 질문 있습니다. lysis 하기 전에 한번 정도 워싱을 하는데, 이때 샘플마다 pbs를 1ml, 2ml 정도 다르게 넣고 워싱을 했는데 정량에 문제가 있을까요 ㅜ
회원작성글 오이가싫어  |  11.22
Q. western blot시 band size가 target protein과 다르게 나옵니다
안녕하세요. western blot을 배우기 시작한 대학원생 입니다. 이번에 western을 했는데, target protein과 너무 다른 size에서 밴드가 떠서 질문을 드리게 되었습니다. target protein의 분자량은 약 30kDa이고, primary antibody의 data sheet에도 32kDa라고 나와있습니다.  근데 western 결과를 확인해보니 약 70-80kDa 정도에서 밴드가 떴습니다. sample을 약 20개 정도 찍어봤는데 전부 해당 size에서 밴드가 확인됐습니다.  혹시 왜 이렇게 나오는지 설명해주실 수 있으실까요? 찾아보고 있고, 계속 찾아볼 예정이지만 혹시 도움을 받을 수 있을까 해서 여쭤봅니다.  감사합니다!
회원작성글 주먹밥김  |  11.22
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