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BioLab 이은열 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
Cell Biology Microbiology Plant Biology Laboratory Animals
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Buffer/Reagent Bioethics Etc.
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Q. western blot reprobing 관련 membrane
western blot membrane을 교체하려고 고민중이라  관련된 질문 남기려고 합니다!   기존 PVDF를 사용하고 있었는데 strip이 전혀 되지 않아서 한번만 사용 후 매번transfer까지의 과정을 다시 진행했는데요 !   PVDF의 경우 Reprobing이라는 과정을 따로 진행하는 것으로 보이는데 이 과정이 Stripping과는 별개인가요 ?    현재 NC로 변경하여 stripping을 하여 사용하려고 찾아보던 중이였는데 reprobing 과 stripping의 차이점을 모르겠어서요 ㅠ  답변부탁드립니다. 
회원작성글 랄리  |  09.26
Q. western detection 문제 첨부파일
<사진첨부>   웨스턴 detection을 하였는데 왼쪽부분은 밝고 오른쪽 부분은 검게 배경이 나왔습니다... 혹시 이거 왜 그런걸까요ㅜㅜ 카메라 문젠가도 생각해 봤는데 같은 카메라로 다른 학생이 찍을 땐 안 그러는데 제것만 이렇게 뜨네요,,    그리고 전체적인 background도 까매서 밴드가 잘 안보이는데 이건 왜 그런걸까요,,,,,,, loading control이라서 잘 보여야 정상인데 ㅜㅜ
회원작성글 쿵쿠따리쿵쿠따  |  09.26
Q. Lugen sci 사의 sensi-Q2000 chemidoc 사용하시는 분 계신가요
안녕하세요 현재 western blot을 처음 해보는 초보 대학원생입니다. 저희 실험실에 Lugen sci 사의 sensi-Q2000 chemidoc 기기가 있어 western blot의 band 확인을 하려고 합니다.  기존에 저희 실험실에서는 저 기기를 DNA 전기영동 이미지를 찍는데에만 사용했어서 western blot 이미지를 찍을 수 있는 설정 및 조건을 전혀 모르겠습니다 .. 업체에서는 더이상 생산되지 않는 제품이라 담당자가 없다고 하시구요 혹시 사용하시는 연구실 있으시면 이미지 촬영 설정 및 조건에 대해 알려주실수 있으실까요..? 부탁드립니다 ㅠㅠ
회원작성글 ㅇㅎㅇㅎ  |  09.26
Q. western blot band shape에 대해서 여쭤볼게 있습니다
안녕하세요  western blot을 진행했는데 detect 후에 band를 보니 band가 가운데가 비어 두겹처럼 나와있더라구요 ㅜㅠㅜㅠ   loading할때 intensity가 너무 높아서 빨리내리다보니 band 가운데가 비어있게 된걸까요 ? protei은 30ug, gel은 fastcast kit 사용했습니다    western 초보라 아직 data 해석에 미숙해서요 ㅠㅜ 아시는분 답변 부탁드립니다 ...    band 라인은 하나입니다 ,..!!    +)다른 gel의 band는 휘어지게 나왔는데 이 이유도 아실까요 ??  같은 gel이여도 휘어진 band랑 안휘어진 band랑 공존합니다 ㅜㅜ     >위에 첨부한 두 사진들의 결과는 모든과정을 동일하게 동시에 진행했으며, Ab만 다른아이들입니다 ㅜㅜ  
회원작성글 뚜리  |  09.24
Q. BCA assay 이거 맞을까요?
안녕하세요  BCA assay를 하기 위해 준비중입니다. BCA A 와 BCA B를 49:1의 비율이라고 할때 BCA A가 이 제품이 맞는지 확인부탁드립니다.  
회원작성글 AD석사생  |  09.22
Q. WB/ 1,2차 antibody
안녕하세요  WB 1차 2차 안티바디에 대해 아직 정확한 개념이 잡히지 않아서 글을 남기게 되었습니다. WB를 actin으로 단백질을 확인하고자 합니다.   1차 안티바디와 2차 안티바디를 사용하려고 하는데 이렇게 사용을 하면 되는지 확인부탁드립니다.   1차 안티바디는 rabbit 이며, 2차안티바디는 HRP rabbit입니다.   윗선배가 없는 상황이라 너무 기초적인부분을 올려서 죄송합니다. 이전 교수님께서 설명해주시기로는 HRP가 발광을 한다고 하셨던걸로 기억을 합니다. 그래서 2차 안티바디는 HRP가 적혀있는걸 사용해야 dectetion을 했을 때 band가 나온다고 하신걸로 기억합니다.    1차 안티바디     2차 안티바디
회원작성글 AD석사생  |  09.21
Q. transfer 후에 marker는 사라지고 portein은 확인되는 현상 첨부파일
안녕하세요, 대학원 석사 과정 중에 있는 학생입니다. 제목에서처럼 western blot 진행 과정에서 transfer 전에는 marker가 잘 확인 되었고, transfer 후에 gel에는 없지만 membrane에서 marker가 확인되지 않아(정확히는 매우 연하게, 없다싶을 정도로), transfer가 잘 되지 않았다고 판단했습니다. 그래도 혹시 몰라 antibody를 붙여 확인해보았는데, beta-actin 기준 protein 밴드가 뚜렷하게 나타나서... 혹시 transfer 후에 marker는 사라졌으나 protein은 잘 옮겨가는 경우도 있나요? 제가 그 membrane과 똑같은 조건으로 다른 membrane도 동시에 실험 진행 중이었는데, 다른 membrane은 marker가 잘 확인 되었고, protein도 잘 나타났습니다. transfer buffer는 똑같은 것을 사용했기 때문에 문제가 없다고 생각하고, 한 기기에서 두 개의 transfer tank를 연결했기 때문에 기기의 문제라고 보기도 어렵다고 생각합니다. 전압은 100V, 100분으로 설정하였고, gel 농도는 10%입니다. 사진은 beta-actin이고, marker가 확인 된 것과 안 된 것 입니다.(동시에 진행된 membrane입니다.) 혹시 비슷한 경험과 원인, 조언 주시면 감사하겠습니다ㅜㅜ
회원작성글 shinhwa  |  09.20
Q. SDS page 밴드 번짐? 첨부파일
안녕하세요  SDS-PAGE실험 중 궁금한게 생겨서 질문남깁니다.  이전에는 이런경우가 거의 없었는데 최근에 젤 러닝 후 염색하면 항상 레인 밖으로 번지듯이 내려오는게 보여서요  혹시 원인이 뭔지 아시는 분 있으신가요? 그리고 저렇게 내려온 경우 western blot 과정에서 문제가 생길 수 있나요?
회원작성글 ㅇㅎㅇㅎ  |  09.19
Q. protein induction이란게 뭔지 잘 이해가 안됩니다..
cell에 IL-1b or LPS 처리 후 con에 비해 변화한 western blot band를 두고 선배들이 induction이 잘 된 것 같다고 설명하더라구요. induction과 expression의 차이가 있나요? cell에 IL-1b나 LPS를 처리하면 염증성 사이토카인등이 분비될 것이고.. 그럼 염증 마커들을 확인했을때 마커 두께가 두꺼워 질 것이고..그렇다면 발현이 증가한 것 아닌가요..? induction이라는게 정확히 이러한 실험에서 어떤 상황을 이야기하는 것일까요...?  
회원작성글 gamja  |  09.18
Q. westernblot 트랜스퍼 시 두 멤브레인의 경향성이 다르게 나와요
wet 트랜스퍼 할때 pvdf 카세트가 두개 들어가잖아요? 트랜스퍼 돌릴때 같은 샘플로 1번, 2번 pvdf 카세트에 트랜스퍼 한 후, 2개 멤브레인에 항체 반응을 하면 1번 2번 멤브레인의 밴드가 경향성이 같게 나오지를 않네요. 이런 경험 하신분 계실지, 어떻게 해결하셨는지 아시는분 혹시 있으신가요? 
회원작성글 AGCT  |  09.15
Q. Heat shock
Ip 하고 heatshock 5분 정도 하려고 했는데 15분정도 방치해버렸습니다ㅠ 샘플이 아까워서 wb까지 진행했는데 flag은 나오는데 다른 항체에서는 안보이네여,, 원인을 찾고있는데 heat shock 오래한게 크게 문제가 될까요..?
회원작성글 바닷가  |  09.14
Q. 전기영동 관련 질문드립니다.
안녕하세요.   Cell에서 천연물의 활성을 확인하기 위하여 웨스턴블롯을 진행하고 있습니다.   실험실의 전기영동 프로토콜대로 실험을 진행하고 있으며 결과는 만족스럽게 얻고 있습니다. 평범하게 실험하던 도중 궁금하던게 떠올라서 질문드립니다.   프로토콜에 따르면 겔을 만들고 샘플을 로딩할때 양쪽 끝에 샘플버퍼(실험실에선 2x laemmli sample buffer 사용함)을 로딩하고, 양쪽 끝에서 두번째에는 마커를 로딩하고 있습니다.   혹시 양쪽 끝에 샘플버퍼를 로딩하는 이유를 질문드려도 괜찮을까요??   감사합니다.   항상 궁금하던 질문이어서 계속 찾아본 결과.. 결국 못찾았습니다.  
회원작성글 생약학  |  09.13
Q. overexpression 이후 WB 결과 제가 원하는 protein의 size가 다르게 나옵니다..
Cell에서 Lipofectamine으로 제가 원하는 protein을 overexpression을 한 후에  (Lipofectamine 2000제품 사용하였고 제조회사 protocol로 진행했습니다.) FLAG antibody, target protein antibody로 IB를 진행했습니다.  바라는결과대로 단백질이 expression되어서 FLAG band도 detection되었고 expression한 단백질도 항체 IB를 통해 control에 비해 많이 detection 되었습니다.   (detection은 2nd antibody와 ECL로 film에서 detection하였습니다) 여기서 문제가 있습니다.  band가 더진하게 나오긴했지만, 제가 원하는 단백질의 size는 100kda인데 더 낮은 70kda부근에서 나왔습니다.    glycosylation정도 생각해봣는데 degly form의 사이즈도 88kda 정도 인것 같아서 아닌거 같습니다.    wb결과가 훨씬더 낮은 kDa에서 발견된 이유는 뭘까요??  (항체문제인가 싶어 다른 실험에 사용했는데 문제 없었습니다.)   아시는분 답변 부탁드립니다 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 오우  |  09.13
Q. WB 항체를 고르는 중인데 이 조합이 맞을까요?
연구실에 전임자가 없어서 저 혼자 알아보고 있는데 제가 맞게 이해 한 건가 싶어서 질문드려요... 현재 대장균에서 발현/정제 중인 단백질이 10종류가 넘고, 모두 8x His-tagged protein이라 anti-his tag 항체를 사용하여 WB로 확인하고자 합니다. 현재 연구실에 있는게 NBT/BCIP 용액 뿐이고 이거를 쓰려면 AP conjugate를 구매해야 한다 해서 찾아 본 결과가 모 회사의 이 제품들인데 1차항체: 6x-His Tag mouse Monoclonal Antibody IgG2b (His.H8) 2차항체: Rabbit anti-Mouse IgG F(ab')2 AP   제가 이해한 바가 맞다면 1차항체는 mouse에서 나온 IgG 중 type이 IgG2b만을 모은 것이고, 2차항체는 rabbit에서 생산한 모든 mouse IgG에 대한 항체이지만 IgG의 Fc domain은 인식하지 않는다.... 인데 F(ab')2의 정확한 의미를 모르겠습니다. 이대로 구매해서 사용해도 문제는 없을까요?   그리고 확인할 단백질들이 His tag가 N말단에만 있는 것도 있고, C말단에만  있는 것도 있고, 양 말단 모두에 있는 것도 있는데 아무래도 양 말단 모두에 태그가 있으면 WB 밴드가 조금 더 진하게 나타나나요?  
회원작성글 ckk  |  09.08
Q. 단백질 정량(Bradford/BCA assay) 계산이 잘 이해되지 않습니다..
안녕하세요. western blot을 진행하는데 두 분의 선임이 각각 실험하시는 과정을 보고 정리하여 혼자 실험을 하려고 하는데요,  그런데 두 분의 단백질 정량 계산법이 달라 무엇이 맞는지 정확히 알지 못하여 선생님들께 도움을 구하고자 합니다.   먼저 첫번째 선임의 방법입니다. cell pellet lysis 후 Bradford 방법을 이용하여 standard 농도를 0, 1, 2, 4, 8로 지정 후 측정한 결과입니다.  단백질 100ug의 100ul 샘플용액을 제조하고자 할 때 sample number(Conc.) 넣을 protein 양 reducing buffer sample buffer lysis buffer WT(7.9ug/ul) 100/7.9=12.7ul 100/10=10ul 100/4=25ul 100-12.7-10-25=52.3 #11(6.1) 100/6.1=16.4 100/10=10 100/4=25 48.6 실험에 쓰인 buffer는 lysis buffer : NP-40, reducing buffer : Bolt sample reducing agent(10x), sample buffer : Bolt LDS sample buffer(4x)입니다. 위와 같이 만든 후 각각 30ul씩 따서 로딩 후 전기영동 했습니다. 그렇다면 제가 넣은 단백질 양은 30ug이 맞나요?   다음은 두번째 선임의 방법입니다. 제 담당 선임이셔서 계속 이 방법으로 실험을 진행해야 하는데 계산과정이 이해되지 않아서요.. cell pellet lysis 후 BCA assay kit를 이용하여 측정했습니다. sample number Conc.(ug/ml) ratio to 최소양 샘플 4x buffer 필요샘플양 1x buffer 원하는 final wb 샘플 양 #1 1369.500 5.989 26.5ul 13.27ul 66.23ul 106ul #5 228.667 1.000 26.5 79.50 0.00 106 실험에 쓰인 buffer는 lysis buffer : M-PER mammalian protein extraction reagent, sample buffer : Bolt LDS sample buffer(4x)입니다. 1x buffer는 4x buffer를 H2O에 희석하여 만들었습니다. 위와 같이 만든 후 각각 30ul씩 따서 로딩 후 전기영동 했습니다. 위 표대로 만든 샘플은 106ul에 각각 228.667ug의 단백질을 가지고 있는 건가요? 30ul를 로딩했을 때 제가 넣은 단백질 양은 어떻게 되나요? 최저농도로 나온 샘플의 양이 얼마인지 피펫팅으로 대략 파악 후 엑셀에 대입하여 주신 자료입니다. 왜 이렇게 최저농도인 샘플의 양에 맞춰 나머지 샘플 모두 계산을 하는 것인가요? 첫번째 선임의 실험방법보다 이 실험법이 더 정확한건가요? H2O 대신 1x buffer를 넣는 이유는 무엇인가요?   그리고 만들어진 gel을 사용하는데 well 안에 running buffer를 채운 후에 샘플 loading 해도 되나요? 빈 well은 소량의 ladder를 넣은 후 샘플과 동량 맞추기 위해 부족한 양만큼 1x sample buffer를 넣어주나요? transfer 할 때 filter paper와 membrane이 함께 들어있는 novex filter paper sandwich 0.2um pore size를 이용하는데요, methanol에 담갔다가 transfer buffer에 적셔 이용하는 것은 filter paper인가요? membrane인가요? 
회원작성글 notorious..  |  09.07
Q. PARP-1, Caspase3, p53 질문드립니다.
안녕하세요. 현재 암세포에 약물 처리 후 apoptosis보는 중입니다. ​ western중에 궁금증이 생겨 질문드립니다. ​ 1. parp-1(cell signaling 9542s) 를 봤는데 이러한 형태가 나왔습니다. (순서 - 10uM, 5uM, 1uM, control)      total form, cleaved form 둘다 증가하는데 다른 논문들을 보면 cleaved form은 증가하나 total form이 일정하거나 줄어드는 경우가 있더라구요. 어떻게 해석을 해야할지 모르겠습니다.. ​ 2. caspase3(cell signaling 9662s)를 봤을때입니다. (순서 - 10uM, 5uM, 1uM, control)    total form은 줄어드는데 cleaved form이 detect되지 않습니다.  듣기로는 caspase들의 cleaved form은 잘 보이지 않는다는데 팁이 있다면 부탁드립니다.   3. P53이 53사이즈에 나오지 않고 40정도에서 detect됩니다. (cell signaling 2524s) cell은 DLD-1, HCT-116입니다 아직 phospho form은 못봤지만 일반 p53이 하나도 안뜨는건 아닌거같고 40에 뜬 밴드는 그냥 무시해도 좋은 잡밴드일까요?   protocol dead cell까지 harvest 하여 sample을 제작하였습니다. 15%, 10% gel Loading, stacking 50V / separating 100V 250mA 70min transfer (in ice) blocking(5% skim milk/ 1h RT), 1st ab(5% BSA/ 1:1000 4도 O/N), 2nd ab(5% skim milk/ 1:10000 1h RT) 각 과정 사이의 washing은 TBS-T 5min 3회입니다. ​ 읽어주셔서 감사합니다.
회원작성글 셀러문  |  09.07
Q. 웨스턴 running시 끌리는 현상 첨부파일
tissue에서 추출한 protein sample로 running을 하는 중에 사진 처럼 끌리는 현상이 몇 개 있어서 왜이렇게 된 것인지 여쭤보고자 글을 올립니다. 처음 loading할 때에도 약간 sample이 뭔가 물기 없는 슬러쉬 같이 살짝 굳어보였습니다...
회원작성글 별헤는밥  |  09.06
Q. low MW western 실험 도움 요청합니다.
안녕하세요. 4kDa 단백질(amyloid beta 42) 잡기 위해 웨스턴 조건 잡고 있습니다. 맴브래인 단백질이 최대한 잘 붙게 하기 위해 아래와 같은 조건으로 진행을 했습니다. 그런데 사진처럼 5kDa 근처 맴브래인만 특이적으로 투명화 되는 현상이 반복적으로 일어나고 밴드가 잡히지 않습니다. 이런 현상이 일어나는 원인이 무엇인지 알고 계신 분 자문 부탁드립니다... 그리고 low MW 단백질 잡기위한 좋은 팁 알고 계시다면 첨언 부탁드립니다.   <웨스턴 조건> 1. Gel casting - 4~20% gradient gel 사용 - Running at 100V for 50~60min   2. Transfer - MeOH per ct. 40% (맴브래인 접착 높이기 위해 40%로 높임) - Membrane pore size: 0.2um (PVDF) - 70mA for 1hr - After transfer, membrane boiling (T-TBS(0.05%) for 5min) and semi dry   3. Blocking - 3% BSA in T-TBS for 1hr   4. Antibody -1st antibody con.c 1:1,000 in T-TBS(0.05%) -2nd con.c 1:10,000 in T-TBS (0.05%)   5. Wash - 0.05% T-TBS( wash 하면서 단백질 lose 줄이기 위해 트윈 20 비율 줄임)
회원작성글 seraph924  |  09.05
Q. 콜라겐펩타이드 확인방법
안녕하세요! 혹시 콜라겐펩타이드 확인방법 있을까요? 식물에서 추출한 콜라겐을 효소를 가해 처리하면 콜라겐펩타이드가 된다고 특허에 많이 나와있는데 저분자콜라겐이라는 증명이 없더라구요 특허에 보면 200dal 또는 300da톤 이라는데 왜 확인방법은 없을까요? 답변좀 부탁드립니다.
회원작성글 Sdr  |  09.03
Q. 웨스턴 블랏용 단백질 추출
보통 60파이에 seeding 한 cell에 drug를 24시간 treat하고 난 뒤, western blot sample을 준비합니다.  1.죽은 cell까지 harvest하기 위해, media를 suction하지 않고 media는 걷어서 1.5 ml tube에 모은뒤에 2.10000 rpm에서 30 sec - 1 min 동안 centrifuge를 하여 pellet이 만들어 지도록 합니다.   3.media를 suction한 후, cell pellet을 ice에 박아둔 뒤  4.부착되어 있는 cell을 한번 피비에스로 워싱한후 lysis buffer을 넣어서 lysis 되도록 놔둔 후, 스크래퍼로 cell을 긁고나서 3번 cell pellet에 함께 넣어 cell이 잘 lysis 되도록 피펫팅을 여러번 합니다.  5. 4도씨 냉장고에 10분간 넣어두거나 ice에 박아둔 상태로 30분간 놔둡니다. 6.12000 rpm에서 10분 또는 15분 동안 centrifuge를 한 후 pellet이 생기면 상층액만 따서 추후에 BSA로 정량을 합니다 이때 피비에스로 워싱하는 과정을 생략해도 될까요? 
회원작성글 카스테랑  |  09.02
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