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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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Q. WB 실험 시 protein 양이 모든 marker에서 동일해야 할까요?
안녕하세요, 논문을 읽다 질문이 생겨 문의 드립니다. WB 시 protein 양을 모든 well에 같은 양 걸어주어야 특정 protein의 발현 변화 정도를 비교할 수 있잖아요, 만약 제가 여러 protein을 확인할 때에도 반드시 매번 같은 양을 걸어야 할까요? 제 말은, blot 내에서 아시다시피 b-actin은 10ug만 걸어도 잘 나오지만 어떤 protein은, 특히 phospho form은 10ug로는 잘 안 나오는 경우가 있습니다. 이럴 때 b-actin은 그대로 두고 phospho form의 양을 조금 늘려서 loading하는 것이 가능할까요?   그리고 어떤 논문의 경우 20ug 걸었다, 어떤 논문은 18~22ug의 양을 걸었다라고 쓰기도 하던데 뭔가 통상적인 protein loading 양의 허용범위? 같은 것이 있는지도 궁금합니다.   감사합니다.
회원작성글 릴미  |  02.08
Q. Exosome isolation 후 western blot확인
여러 sample(Cultrure media/Urine/Serum/Plasma...)에서 exosome을 다양한 방법(Ultracentrifuge, PEG kit, filtration 등등)으로 isolation 후 각 방법별로 효율을 비교하고자합니다. 이때, protein 정량 후 protein의 양을 맞추고 loading하는 것이 맞을까요? 아님 yeild의 개념으로 같은양을 loading하는 것이 맞을까요? ex] 만약 모든 방법을 동일하게 sample 1ml으로 start하여 마지막 elution을 50ul으로 한다면  a) 50ul를 정량 후 20ug씩 loading  b)추출 효율 비교니까 모두 동일하게 20ul씩 loading 사실 두방법 모두 실험 해봤지만 그렇게 큰 차이가 나지는 않습니다.  논문이나 각 commercial kit을 flyer를 찾아보면 western blot후 확인하던데 method을 봐도 그런거까지는 말해주지 않으니까요...  Exosome을 주로 실험하시는 분들은 어떻게 western을 하시는지 궁금합니다! Exosome을 연구하시는게 아니더라도 다양한 분들의 의견이 궁금합니다. 다양한 의견 부탁드립니다!
회원작성글 liilllijli..  |  02.08
Q. transfer후 폰슈 묻혔을 때 일정하게 나있는구멍
제목 그대로 transfer후 폰슈를 묻혀 젤에서 잘 넘어왔는지 확인하는데요.. 멤브레인에 일정하게 동그랗게 구멍이 난 것 처럼 폰슈가 안묻힌 상태로 육안으로 확인이 됩니다. 무슨 구멍인지 대조해보았는데, 멤브레인과 젤 그리고 3m paper을 잡아주는 카세트의 구멍과 일치하는 간격과 크기였습니다. 카세트 구멍대로 폰슈가 안묻혀지며, detection과정에서 구멍이 나있던 부분의 밴드가 매우 희미하게 detection됩니다.. 신생연구실도 아니고, Western blot anlaysis가 메인인 연구실이라, Western Blot analysis과정 조건의 문제는 아니라고 확신할 수 있습니다.. 해당 증상을 겪으셨던 분들이나, 고견이 있으시면 공유부탁드립니다. 감사합니다.
회원작성글 딸판바  |  02.07
Q. Streptavidin (conjugate용) 국내 제조업체 문의
안녕하세요.  현재 streptavidin conjugate 실험을 하고 있습니다. streptavidin 1g 이상 한번에 구매를 하고 싶은데요. 혹시 국내 제조업체가 있을까요? 문의 드립니다. 
회원작성글 전사  |  02.06
Q. Immunoprecipitation 후 immunoblot 결과 해석
논문을 보던 중 Western blot 결과 해석이 어려워서 질문드립니다ㅠㅠ... 질문은 크게 두가지입니다.   예를 들어, A단백질은 B, C, D와 complex를 형성한다고 했을 때, [질문1] Q단백질을 knockdown시킨 cell lysis에서 A 단백질을 Immunoprecipitation 후, B,C,D 단백질에 대한 antibody로 western blot을 하였을 때, 컨드롤(scrambled control)에 비해 B의 증가량이 C, D의 증가량에 비해 매우 크다는 것은 무엇을 의미하나요? [질문2] 위 질문의 연장선으로,, Q단백질을 knockdown시킨 cell lysis에서 B 단백질을 Immunoprecipitation 후, A,C,D 단백질에 대한 antibody로 western blot을 하였을 때, 위의 질문결과와 다르게, A,C,D의 증가량이 유사했다는 것은 무엇을 의미하나요?
회원작성글 옹듸  |  02.04
Q. western blot band 개선 좀 부탁드립니다 ㅠㅠ
western blot을 진행하고 있는데 아래사진처럼 dot 처럼 나오는 문제의 원인을 파악하지 못해서 이렇게 질문드립니다.... 단백질 사이즈 ; 14,16kDa 15% SDS-PAGE, Bio-rad 사용 Running ; 100volt, 2h 30min   Transfer ; 100volt, 1h 일단 이런식으로 dot으로 나오는 게 아래의 작은 size 단백질만 그렇고 GAPDH나 다른 사이즈 단백질은 크게 문제 없이 나옵니다.... 작은 사이즈의 단백질에 대해서 해당문제를 해결하려면 어떻게 해야하는지 도움부탁드립니다..
회원작성글 뚜둥  |  02.04
Q. Western blot 발현량 측정 방법 질문드립니다.
안녕하세요. 공부 중에 궁금하여 질문드립니다.. 웨스턴 블롯이 타겟 단백질이 있는지 없는지 유무를 확인하는 방법이라고 이해를 하였는데요   혹시 RNA 발현량 알아보는 qPCR 실험 같이 타겟단백질의 발현량(?)을 확인하는 정량 실험은 어떤 방법이 사용되나요? 어떤 실험법으로 찾아야 공부할 수 있는지 몰라서 질문드립니다 ㅠㅠ  
회원작성글 흰털누누  |  02.03
Q. western blot 시 중단할 수 있는 단계는??
안녕하세요. 저희 랩이 조마간 이사를 가게되면서 실험 장비들을 새로 셋팅을 하게 됐는데요. chemi doc이 너무 고가라 여건이 안되서 이사 전 입주해있던 곳의 장비를 사용해야 될 것 같습니다. 그런데 거리가 1시간 거리이기도 하고 거기에 연구공간도 없고 보관 장소도 없으니 필요한 물품은 직접 들고가서 장비만 후딱 쓰고 다시 복귀해야될 것 같은데,    1. blocking 단계에서 shaking 후 blocking buffer에 담가놓고 1차 항체 들고 1시간 이동. 냉장 창고에서 o/n 진행시키고 다음 날 2차 항체 들고 다시 현장으로 이동. 2차 반응/세척 후 ECL 반응시켜 chemi doc 과정 진행. (이동 중 항체에 문제가 생기지 않을지 걱정...) 2. 2차 항체 붙이고 반응 완료후 TBST에 담가놓고 이동. 현장에서 washing 마무리 하고 ECL 처리해서 chemi doc 진행 (1시간 이동하는 과정 중에 2차 항체가 씻겨나진 않을까 걱정...)    중에 어떤 방법이 더 좋을 지 알 수가 없어서 물어봅니다. 이 외에 더 좋은 방법이 있을까요??
회원작성글 민드  |  02.03
Q. nitrile glove 투과도
요즘 western blot을 자주하는데 methanol이 든 transfer buffer 내에서 작업하는 과정에서 nitrile glove가 과연 100% 화학물질을 차단해주는가라는 걱정이 됩니다..! 기분탓인진 몰라도 장갑을 껴도 100% 방수가 되는 느낌이 아니라서요..ㅠ nitrile 장갑만 끼고 transfer buffer에 손을 넣고 실험을 해도 안전할까요..?
회원작성글 Labtor  |  02.02
Q. WB시 beta-actin을 껴서 하는 이유
이번 방학에 연구실에서 western blotting 하고 있는 학부생입니다.  transfection된 cell에서 protein을 추출한 뒤 WB할 때 타겟Ab말고 beta actin을 같이 하는 것은 이유가 무엇인가요? 그냥 actin이 가장 진하게 나와서 잘 됐는지 확인하는 용도인가요? 수준 낮은 질문 답해주셔서 감사합니다.
회원작성글 앞구르기  |  02.02
Q. western antibody
안녕하세요    WB 할떄 1차 , 2차 안티바디 구분하는 법이 어렵습니다. ㅜㅜ   항체, 항원에 대한 개념과 1차 2차에 대한 개념이 있다고 하기엔 부족하고 없다고 하기엔 있는거 같습니다. 1차 항체 : A라는 동물에 target 단백질을 주사해서 만든 Ab   - 2차 항체 : B라는 동물에 A라는 동물의 IgG를 주사해서 만든 IgG       어떤 원리로 어떤 방법으로 1차 2차를 붙히는지는 알겠지만  예를 들어 actin을 확인하고자 하면 1차 안티를 anti- actin antibody in Rabbit 이라고 하면 2차 항체로 Rabbit lgG (HRB) 를 쓰는데  그러면 1차에 Rabbit를 쓰고 2차를 goat를 쓰면 안되는건가요??   1차를 rabbit을 쓰면 2차도 rabbit을 써야하는지 아니면 goat를써도 되는건지에 대한 개념을 못잡겠어요 ㅜㅜ  매번 누구한테 이렇게 쓰면 되냐고 물어볼수도 없고 공부할수 있는 좋은 방법이 없을까요?
회원작성글 AD석사생  |  02.01
Q. 면역염색이나 wb 실험시 2차 antibody관련 질문
필요한 1차 항체를 몇가지 찾다가   source에 rabbit과 rabbit IgG 가 구분되어서 적혀 있던데,   둘 다 2차 antibody를 rabbit으로 사용하면 되는건가요?   아니면 rabbit IgG에 맞는 2차 antibody가 있는건가요? 구분해서 붙여야 하나요?
회원작성글 용구리  |  02.01
Q. phspho protein 웨스턴 블럿 잡band
phosphorylated protein 웨스턴 블럿시 nonspecific band가 찾고자하는 band를 구분할 수 없을만큼 많이 생기면 어떻게 해결해야하나요..? phospho protein이라 skim milk를 사용할 수 없어서 5% BSA로 blocking, 항체처리를 하고 있는데 blocking 시간을 늘려보기도 하고 항체 농도를 바꿔봐도 진전이 없습니다ㅠ
회원작성글 Labtor  |  01.27
Q. JNK 질문이요
안녕하세요   p-JNK를 보고 JNK를 확인하려니 JNK1 안티바디와 JNK2 안티바디가 각각 있네요  이럴땐 어떤걸로 토탈을 확인해야할까요?    고맙습니다
회원작성글 졸려요  |  01.27
Q. WB(Western Blot) 시 a-tubulin이 일정하지 않게 나오고 피펫팅에 관한 질문
안녕하세요. 실험실 초보 석사 1학기 대학원생입니다.  현재 실험실에서 western blot실험을 할 때 a-tubulin을 housekeeping으로 사용하고 있는데 일정하게 나오지 않고 있습니다.  모든 protocol을 익숙히 하고 실험을 진행하고 있는데도 불과하고 일정하게 나오지 않는데 아무래도 피펫팅이 큰 문제로 되고 있는것 같습니다. 일정하게 나오지 않게 되는 문제초래점 몇가지 제시해 주시길 바랍니다.   Ps. BCA assay로 protein정량을 진행하고 있는데 R^2=0.98~0.99로 나오고 있습니다. 실험을 오래 해오신 선배님들의 조언을 바랍니다~~^^
회원작성글 Lanna  |  01.25
Q. western blot : transfer 질문입니다
안녕하세요?? western blot에 어려움을 겪고 있는 석사생입니다~ 저는 melan A cell protein  30 μg 사용합니다.  SDS gel을 runnning 하고 membrane에 transfer를 하는데요~ transfer하고 난 뒤 폰슈 염색을 하면 (사진처럼) 자꾸만 깨끗하게 transfer 되지가 않아서요ㅠㅠ transfer는 2.5 A 25V에서 30 분정도 실시하구요.  처음 해봤는데 뭐가 문제인지 모르겠습니다. ㅠㅠ
회원작성글 karan  |  01.25
Q. 단백질 사이즈 측정 HPLC로 할 수 있나요?
고분자량을 쪼개서 저분자량 단백질 (5kDa 내외) 로 만드는 실험을 하고 있는데요. HPLC를 처음 찾아봐서 질문드려요 ㅠ   사이즈를 계속 확인하면서 테스트 해야할 것 같은데 SDS PAGE는 세팅도 안되어있고 실험이 오래걸릴 것 같아서..   HPLC는 의뢰 맡기려고 하는데 단백질 사이즈 확인할 때 SDS PAGE를 HPLC로 대체할 수 있을까요? 사이즈마커로 분자량을 알고있는 시료 (예로 10kDa, 5kDa 갖는 것들..)랑 같이 걸어서 사이즈를 유추한 데이터를 논문용으로 SDS PAGE 대체해서 올릴까 생각하는데 가능한 방법 맞을까요..   감사합니다!
회원작성글 GE  |  01.20
Q. SDS-PAGE 결과에 대한 질문이 있습니다.
Ni-NTA 친화 크로마토그래피를 통해 정제한 his-tag가 달린 단백질을 sds-page를 한 결과입니다. 크로마토그래피를 할때 elution을 다섯 번 했고, 각각 다른 tube에 elution 했습니다. 왼쪽부터 순서대로 elution 1, elution 2, elution 3, elution 5, elution 4  입니다.   1) 왜 elution 횟수가 늘어날수록 정제한 elution의 진하기가 옅어지는지 궁금합니다. 2) 네 번째에 있는 elution 5의 결과는 왜 다른 elution들에 비해 깨끗하게 결과가 나오지 않았는지 알고 싶습니다.
회원작성글 바테크  |  01.18
Q. SDS-PAGE 결과에 대한 질문이 있습니다. 도와주세요..
sds page를 하고 질문이 있어 질문 올립니다.   1) Ni-NTA 친화 크로마토그래피로 정제해 얻어낸  elution(대장균의 his-tag 단백질)에서 왜 75kDa가 가장 많이 나온건지 모르겠습니다. 그저 이 단백질에 75kDa가 많이 들어있어서 그런건가요? 2) washing을 두 번 하고 각 washing에서 얻어낸 wash I, wash II에서는 대략 25kDa가 가장 많이 정제된 것을 확인할 수 있었는데 이 wash는 무슨 이유로 elution과 다른 결과를 보이는 건가요? 3) sds page의 결과로 나타난 밴드의 해석은 어떻게 하는 건가요?  (예를 들어, 밴드의 길이, 밴드의 진하기 등)   질문이 애매해 죄송합니다. 그래도 답변 달아주신다면 정말 감사하겠습니다!
회원작성글 바테크  |  01.18
Q. protein size?????
웨스턴을 진행해서 봐야할 타겟 단백질이 Caspase-1 이라는 protein인데요. 이 protein의 size를 알고 싶어서 cell signalling이라는 사이트에 들어가서 caspase-1을 검색해보니까 MW 20, 22 이렇게 나오는데 이게 이 protein의 size 범위가 20~22라는 건가요? 그리고 IL-1β 같은 경우는 17,31 이렇게 나오는데 이런 경우에는 왤케 레인지가 큰 건가요? 단백질의 size가 정해진 게 아닌건가요??
회원작성글 남홀  |  01.18
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