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BioLab 이은열 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > etc.
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질문/투표/프로토콜 등록
Q. Native gel 양쪽으로만 세게 염색되는 현상 첨부파일
기존 bio-rad precast gel 4-15%을 사용하여 Native gel 단백질을 분석하는데 실험 비용을 줄이고자 동일한 스펙에 다른 회사 Precast gels을 사용했는데 밴드가 예쁘게 나오지 않고 저렇게 양쪽으로만 세게 염색이 됩니다. 혹시 무엇 때문인지 알 수 있을까요? 참고로 Marker는 동일하게 잘 내려갑니다.
회원작성글 외계인눈깔아왱  |  09.26
Q. PD-10을 이용한 buffer exchange 관련 첨부파일
안녕하세요. PD-10을 이용한 buffer exchange 관련해서 질문이 있습니다. 제가 protein을 주로 다루지 않고 화학분야라 처음해봐서 어려움이 많네요 ㅠㅠ 제가 할 것은 His tag protein의 조성이 실험에 영향을 주어 Buffer exchange를 하려고 합니다. 이때, PD-10 column이 제 실험에 적합할 것 같아 사용하려고 합니다. - Storage condition : 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 125 Mm imidazole, 50% Glycerol (v/v) - Exchange 후 condition : PBS   질문 : 1) Glycerol 50% (v/v)이 viscosity하여 column하는데에 영향을 줄 것 같아 dilutio해서 진행하려고 하는데 어느 정도 %로 할지 궁금합니다. 서치해보니 5~10% glycerol 정도는 PD-10 으로 가능할 것 같은데 기준 같은 것이 있을까요? 잘 분리되는지 여부는 small scale로 test를 해봐야 아는 걸까요?   2) Gravity protocol 에서 elution 단계에서 3.5 mL를 받는다고 적혀있는데 보통 하나의 test tube에 전부 받는지, 아니면 조금씩 (약 0.5 mL) 씩 나눠 받는지 궁금합니다. 또한, 3.5 mL 를 받고 나서 추가적으로 더 elution buffer를 넣어서 collection하진 않을까요? Protein이 다 나오지 않았을 수 도 있으니까요.   프로토콜 첨부하겠습니다. 도움주시면 감사하겠습니다. ㅠㅠ
회원작성글 감자랑나랑  |  09.21
Q. MS를 이용한 항체 epitope mapping 서비스 제공하는 국내 회사 추전 부탁드립니다.
국내사 중에 HDX-MS 혹은 XL-MS를 통한 epitope mapping 하는 곳들이 있을 까요? 전문적으로 하는 곳 추천 받고 싶습니다.
회원작성글 shkim20  |  09.20
Q. cy5.5 염색
대장균에서 발현/분리/정제한 단백질에 cy5.5 dye를 염색하는 것이 실험실에서 간단히 되는 일인가요?  지식도, 경험도 부족하고, 주변에서 본 것도 없어서 ㅜ.ㅠ 단백질에 염색한 후 마우스에 주입해서, 이 단백질이 어디로 가는지 보는 실험을 하려고 합니다. 일단 염색이 석사생 손에서 수월하게 뚝딱 되는 것인지가 궁금하고요, 또 염색이 잘 되면, 마우스에 들어가서도 하루-이틀 안깨지고(?) 잘 버티는지가 궁금합니다. 이건 케바케일 것 같아 꼭 답 안해주셔도 됩니다!
회원작성글 색연필  |  09.20
Q. ELISA 진행할 때 같은 샘플에서도 다른 결과가 나오네요;;
안녕하세요.  저는 최근에 Extracellular vesicle 연구를 시작한 대학원생입니다.  EV의 isolation이후 ELISA로 CD63 단백질 발현을 확인하며 EV의 양을 가늠해 보고 있는데요.  문제는 ELISA 결과를 보면 같은 샘플에 대해서도 어떤 well은 반응이 뜨고 어떤 well은 뜨지 않으면서 편차가 굉장히 크다는 것입니다.  물론 손으로 실험 하다보면 당연히 편차는 생기는 것이겠지만 그 정도가 OD 기준으로 10배 가까이 발생하기도 합니다.  혹시 이런 경우 실험의 숙련도와 상관 없이 고려해봐야 하는 이슈가 뭐가 있는지 경험 많으신 분들께 여쭙니다.  감사합니다. 
회원작성글 대학원생327  |  09.20
Q. phosphomimetic mutant에 관해서 질문이 있습니다.
안녕하세요, 논문을 읽으면서 공부하고있는 대학생입니다. 다름이 아니라 논문을 읽으며 phosphomimetic mutant, phosphoinhibitory mutant 같은 용어가 많이 쓰이는것을보게 되었습니다. 그런데 논문을 읽으며 보니phosphomimetic 돌연변이가 있으면 인산화가 잘일어나지 않는다고 하는 것을 보게 되었는데요, 실험에서는 이 돌연변이가 이미 인산화되어있는 상태처럼?기능을 하는 것 같아서요ㅠㅠ 대체 이 두가지 돌연변이가 정확히 무엇인지 알 수 있을까요?
회원작성글 lkdjf  |  09.18
Q. ATP가 없을 때 protein의 phospholylation이 풀릴까요?
안녕하세요, kinase를 넣어 target 단백질의 phospholylation을 진행하려고 합니다.   간단한 기작은 이렇습니다. 두 개의 단백질의 complex를 조성하고 싶은데, 그 중 하나의 단백질에서 phospholyaltion이 일어나면 안정한 complex를 이룹니다. 이 과정에서 kinase와 ATP를 넣어주어 phospholylation을 시켜주는데 후에 complex만을 얻기 위해 kinase를 제거해줍니다.   이때, buffer에서 ATP가 없어지면 complex안의 phospholylation이 풀릴까요? Kinase는 RSK2라는 단백질을 사용합니다. 도움 부탁드립니다ㅠㅠ
회원작성글 코코팜500배  |  09.08
Q. Gelatin zymogrphy,, 도와주세요,, 첨부파일
안녕하세요,, gelatin zymography를 하고 있는데 밴드가 안떠서요,,, 도와주세요ㅠㅠ,, A549 cell을 IL-1b로 자극하여 물질 처리 시 MMP-9이 얼마나 감소했는지 보고자 하는데요,, 밴드가 아에 뜨지않습니다.. conditioned media를 수집한 후 냉동실에 얼려둔 후, 사용 시 꺼내어 농축을 시킨 후 실험에 들어갔습니다.. amicon(Ultracel-50 regenerated cellulose membrane, 2 mL sample volume)을 사용하여 농축시켰는데 centrifuge에 맞지를 않아서 50ml tube에 최대한 고정을 시킨 후 농축을 진행하였고 test로 모여진 농축된 샘플을 사용하여 로딩하였습니다..  Sample buffer, renaturing buffer, developing buffer, simplyblue safestain, gel 모두 시판된 invitrogen사 제품을 사용했구요,,  test라 48hr incubation 시켰구요,, 저 위에 밴드같이 하얀 부분은 scan하려다가 젤이 모서리같은데 찍혔는데 밴드라고 봐야되는건지,, 과정보다는 sample을 모으는 과정에서 문제가 있는것 같은데,, 좀 도와주세요ㅠㅠㅠㅠ 농축이 엉망이더라도 어쨌든 밴드는 조금이라도 보여야되는거 같은데 아에 없는것 같아서 어떡해야될지 모르겠습니다,, 도와주세요
회원작성글 sjsj3636  |  09.08
Q. Amicon filter에서 filtration이 잘 되지 않았던 분 계신가요??
안녕하세요, 제가 단백질에 DNA를 붙이는 bioconjugation 실험을 하고나서 단백질에 붙지 않은 DNA를 Amicon filter를 통해 제거하려고 했는데, 이상하게도 DNA들이 제거가 되지 않더군요.   혹시 Amicon filter 사용해보신 선생님들은 저와 같은 경험이 있으신지 궁금합니다. 제 실험 과정에 대해 짧게 요약해드리면, 일단 DNA는 single stranded DNA(5'Cy5 dye modified)로 Mw:17000정도 됩니다. 단백질-DNA conjugates은 Mw: 55000정도이구요. Amicon filter는 30K로 사용했고, filter후에도 육안으로 Cy5 dye DNA(푸른빛)가 걸러지지 않아서 50K로 Amicon filter를 해주었습니다. 50K filter도 해줬는데도 전기영동(SDS-Page gel)후 17000정도에서 강한 signal의 DNA band가 확인되었습니다. Amicon filtration 과정에서 Centrifuge는 3번(14000g 10min)/ reverse spin(1000g 5min) 1번 해주었는데 과정상에 문제가 있는지 혹은 제가 뭔가를 놓치고 있는게 있을까요? 혹시라도 선생님들께서 저와 비슷한 경험을 하셨으면 어떻게 극복하셨는지 궁금합니다. 감사합니다. 
회원작성글 공부하자공부  |  09.01
Q. IP할 때 antibody 종류가 IgG가 아닌 IgA인데요,
안녕하세요, 제가 정말 많이 연구되지 않은 단백질 A에 대해 co-IP 실험을 하려 하는데, 이 A에 대한 IP 가능한 antibody가 시중에 한 종류 뿐입니다. 우선 이 antibody의 datasheet를 보고 IP 조건을 잡으려 하는데, 이 antibody가 일반적인 IgG가 아닌 IgA type인 것 같더라고요. Host는 mouse이고, 아래가 datasheet 일부 발췌한 것입니다. 그리고 recommended support reagent로 IP 시 듣도보도 못한... A/G가 아닌 protein L agarose를 쓰라고 하더라고요.   Agarose야 datasheet 추천대로 구입하면 되지만 문제는 control Ig입니다. 이 antibody에 대한 negative control는 normal mouse IgA가 되는 것이 맞나요?   IgA antibody가 희귀한 것인지 IgA가 control로 쓰인 논문이 없는 것 같아서 제가 맞게 생각한 것인지 걱정스럽습니다.   IP 많이 해보신 분들이나 아시는 분 도움 부탁드립니다ㅜㅜ
회원작성글 릴미  |  08.30
Q. Detergent insoluble fraction의 IP 실험 질문
안녕하세요,    관심있는 단백질의 protein-protein interaction을 확인하고자 immunoprecipitation 실험을 진행중에 있습니다. 확인하려는 단백질이 detergent insoluble fraction으로 aggregation되면서 IP하는데 문제를 겪고 있어 해결 방법이 있을지 질문드리고자 글 작성합니다.    기존에 일반적인 방법으로 soluble fraction IP를 진행할때는 0.5% NP-40 detergent가 포함된 lysis buffer를 사용했습니다. Protein-protein interaction을 깨지 않으면서 Insoluble fraction도 녹여낼수 있고, IP 실험도 진행 가능한 detergent나 buffer 조건이 있을까요?   Reference를 보고 6M urea로 lysis 후 투석하여 기존의 buffer 조건으로 되돌리는 실험을 진행한 경험이 있으나, 투석 시 Urea가 빠지면서 insoluble fraction이 다시 aggregation 되는 것을 확인하였습니다.    관련하여 조언해주시면 감사드리겠습니다. 
회원작성글 파란돼지  |  08.29
Q. 효소 unit 단위 계산
lipase를 4-nitrophenyl butyrate를 기질로 사용하여 활성 측정 후 그 흡광도 수치를 unit/ml의 단위로 환산하고 싶습니다. lipase는 1min당 1umol소모한 것이 1unit으로 알고 있는데 1min당 1umol이 소모된것을 어떻게 아는지 모르겠습니다. 예를 들어 1% lipase 100uL와 아세토나이트릴에 녹인 50mM 4-nitrophenyl butyrate를 50ul 그리고 25mM sodium phosphate 2.5mL를 넣고 10분 반응해서 흡광도가 348nm에서 0.454가 나왔다면 이것을 unit/ml 단위로 환산이 가능한가요? 아니면 standard를 그려야하나요? 그려야한다면 방법을 말씀해주실 수 있나요?
회원작성글 gythakssmd..  |  08.27
Q. 농도 관련 질문드립니다.
산넘어 산이네요 ㅠㅠ  실험은 안되고 뭐가 문제인지 ㅠㅠ  이번에 생산한 단백질 농도 희석 질문 드립니다.  일단 실험하는 단백질의 mw은 9.97kg/L  로 알고 있습니다.   이번에 생산한 단백질의 농도는 0.611 mg/ml이고 생산량은 5.5ml로  총 3.359mg/ml 이되는데    이번에 6uM, 0.2uM 로 희석을 해야하는데 계산한게 맞는지 확인 부탁드립니다.  6uM 제조  3.359*1000/59.82(9.97*6)=56.15 배 1Mol/56.15=0.0178 1ml 기준 단백질 17.8ul    0.2uM 제조  3.359*1000/1.9994(9.97*2)=1680.0 배 1Mol/1680.0=0.00059 1ml 기준 단백질 0.5ul -6uM 로 제작한 단백질에서 33ul+ 1ml buffer    이게 맞는지 확인 부탁드립니다.   
회원작성글 mito59  |  08.25
Q. 전기영동시 시료와 염색약의 이동의 상관관계 첨부파일
 안녕하세요 과학동아리 전기영동 실험중 의문이 발생해서 질문 드립니다. 전기영동 실험에서 카탈라아제와 같은 시료를 샤프라닌과 같은 염색약으로 염색시켜서 전기영동을 진행할 때 카탈라아제와 샤프라닌이 혼합되어서 분리되는 거 없이 같이 전기영동이 가능한지의 여부를 묻고 싶습니다.     
회원작성글 isak30225  |  08.25
Q. Lysozyme 열 안정성
안녕하세요.  Lysozyme 이 열 안정성이 좋은것을 알고 있습니다. 녹는점이 72°C 이라고 나와있는데 PBS에 녹여서 60°C 정도까지 온도를 올려도 activity 가 잘 나온다는 이야기인가요?? 단백질에 대해서 잘 몰라서 질문드립니다.. 
회원작성글 폰지밥  |  08.24
Q. AIEX 공정액 전처리하면서 수율이 많이 떨어지는데 어떻게 해결할 수 있나요?
CIEX 끝난 공정액 AIEX 하기위해서 시료를 AIEX buffer A로 1/10 희석해주었는데 step yield 계산해보니까 희석하는 과정에서 수율이 이전 스텝 대비 많이 떨어졌어요. CIEX_EP total yield가 92%인데 AIEX_LS 계산해보면 62%거든요ㅠㅠ 아무것도 안하고 희석만 한건데.. (단백질 농도는 둘 다 nanodrop으로 찍었습니다) 여러번 해봐도 저 스텝에서 수율이 확 떨어져서 희석과정에 문제가 있다고 생각이 되는데 이런 경우에는 전처리 과정을 어떻게 바꿔줄 수 있나요? 이번에 처음 정제실험을 해본거라 혹시 관련해서 도움될만한 자료가 있다면 알려주세요 공부해보겠습니다!
회원작성글 지현_이  |  08.24
Q. 기본적인 농도 희석 질문입니다.
제가 ELISA 진행하기위해 1차 항원을 2ug/ml로 만들어서 100ul씩 plate에  분주해서 진행을 하였는데.. 전에 하셧던 분이랑 결과가 많이 차이가 나서  어디서 잘못되었는지 확인해보니 100ng/well 이더라구요 ㅠㅠ 물어볼 사람이 없어서 부끄럽지만 질문드립니다ㅜㅜ  그래서 짧은 지식으로나마 계산 해보니 2ug/ml 항원을 100ng/well이면  well당 50ul가 들어가는게 맞는건지 ㅠㅠ    계산이 맞는지 확인 부탁드립니다.
회원작성글 mito59  |  08.24
Q. zymography할 때 collagenase buffer를 넣는 이유가 무엇인가요
조사해보았을때, collagen degradation시켜주기 위해 넣는다고 되어있던데 실험자체가 MMP-2, MMP-9이 collagen분해를 보기 위함인 것 아닌가요 ?  
회원작성글 엄청난초짜  |  08.24
Q. HPLC 분석 관련해서 질문 드립니다
올해 막 입학한 부족한게 많은 대학원생입니다 . 다름이 아니라 HPLC 비교 분석 관련하여 질문을 드릴려고합니다. 우선 HPLC 버퍼로는 0.01%TFA ACN 을 사용하고 있습니다. 제가 궁금한것은 특정 펩타이드를 분석할 때 기존에 30분동안 ACN을 20%-80%까지 분석할때 19.4분 정도에 피크가 나왔다면 같은 펩타이드를 20분동안 ACN을 30%-55% 로 밀었을때 몇분에서 피크가 생길지 예측할 수 있을까요? 있다면 어떻게 해야할까요. 기본적인 질문인것 같은데 아직 부족한게 많아 이렇게 질문드립니다. 감사합니다.
회원작성글 에우랑  |  08.23
Q. In-gel digestion 할 때 첨부파일
In-gel digestion 할 때 FPLC로 먼저 깨끗하게 목표 단백질을 정제해야할까요? 아니면 FPLC 안한 단백질을 SDS-PAGE한 gel을 그냥 써도 되나요? 단백질 양은 10ul로딩 했을 때 36ug 이상이라서 충분합니다! (사진은 FPLC 안한 단백질액을 SDS-PAGE 내린거예요)
회원작성글 jyun1009  |  08.22
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