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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein
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Q. western house keeping protein
galectin-1이라는 단백질을 transfection 시킨 후, single cell cloning을 거쳐 여러개의 clone을 얻어 gal-1 발현률을 비교해보고 있는데 house keeping 단백질이 계속 흔들립니다.   b-actin도 써보고 a-tublin도 써보는데,  둘다, gal-1이 많이 높게 발현되는 clone에서 그 발현양이 매우 낮습니다.   일단, QPCR로 확인을 하긴 할건데 이 clone들이 다른 유전자가 KO 된 것에 OE를 시킨 것이라 두 유전자의 영향이 있을 수는 있을 것 같긴한데 GAPDH를 써서 한 번 더 해봐야하나  고민 중입니다   comment를 부탁드립니다.
회원작성글 새슬  |  11.30
Q. SDS-PAGE 끌림현상(reducing Vs non-reducing)
안녕하세요!   단백질을 SDS-PAGE로 확인하고 있고, complex 형태를 이루는 부분이 있기 때문에 reducing과 non-reducing 샘플을 항상 비교하고 있습니다. Column work을 한 후에 보고 있는데, 최근 affininty 후에 샘플에서 끌림현상이 확인되고 있습니다. 정확하게는 affinity column 후, reducing과 non-reducing 샘플을 1개의 pre-made(commercial gel) gel에 loading을 하는데, 'non-reducing' 샘플에서만 끌림 현상이 확인되고, reducing 샘플은 깨끗하게 나오고 있습니다.  혹시 어떤 원인이 있을지 궁금합니다. 답변 주신 분들게 미리 감사 인사 드립니다.
회원작성글 sein  |  11.30
Q. Western blot band 질문 첨부파일
RAW 264.7 cell에 단백질로 p-p65등을 western blot으로 보려고 합니다. 근데 화면 지지직 거리는 그런 화면같이 나오거나 crop 밴드 형태만 나오고 band가 안나옵니다. 뭐가 문제인지 모르겠어요. 캐미닥을 쓰고 있고 blocking solution은 Ez blockchmi 쓰고 있고 transfer도 blocking과 같은 브랜드 제품 쓰고 있습니다 고수님들 도와주세요ㅠ 오늘안으로 알아야 되서요ㅠㅠ 급합니다
회원작성글 ono  |  11.30
Q. SDS-PAGE gel 유리판
SDS-PAGE gel 만들때 뒤의 short plate는 철로 된것이고, 앞은 유리로 된거 사용하는데 강하게 나사로 고정하면 유리가 깨지고 약하게 고정하면 젤이 굳기전에 흘러서 만들기가 참 어렵네요. 유리판을 써야하는 이유가 있나요? 플라스틱판이나 아크릴판을 적정크기로 잘라서 유리판대신 사용해서 젤 런하면 안되나요? 플라스틱판은 원래 없는건가요? 감사합니다.
회원작성글 BBlue  |  11.30
Q. ip 실험에 관하여 질문이 있습니다~.
안녕하세요, 요즘 ip실험을 하고 있는 석사생입니다. 저가 ip에 사용하는 비드가 Pierce Protein A/G Magnetic Beads  을 사용하고 있습니다. 이 비드를 사용하시는 분들 중 프로토콜 대로 pH을 이용하여 Elution하는것이 더 효율적인지 아님 2x sample buffer을 바로 넣고 70'c에 끓여서 하는것이 더 효율적인지 좋은 결과가 있는 경험이 있는 분들의 조언이 있으면 합니다.  
회원작성글 genesis  |  11.30
Q. western할때 membrane이 b-actin은 잘 나오는데 나머진 다 너무 어둡습니다 ㅠ 첨부파일
첨부한 사진처럼 b-actin은 그래도 membrane이 괜찮은데 나머지 ab들은 모두 il-10처럼 membrane이 어둡습니다. 1차 ab는 4도씨 12hr 이상 붙였고 그 후에 워싱 10분x3회 2nd ab 1hr 30min 워싱 10분x3회 그 후에 las 촬영했습니다. 대학원생때 이렇게 줄곧 해온 방법이라 왜 이러는지 모르겠습니다. 지금은 las 촬영때문에 ECL 처리 했던 것을 TBST에 넣어두고 있는데 워싱을 좀 더 하면 될까요? ㅠㅠ
회원작성글 dbkorea  |  11.29
Q. semi-dry transfer
Bio-rad 제품 semi-dry transfer 기계를 사용하는데, 저는 여기서 0.45 uM의 PVDF를 씁니다. 혹시 mini와 midi의 차이점이 정확히 뭔지 궁금합니다 ㅜㅜ  저는 midi로 걸었는데 아무 이상 없이 잘 사용해왔는데 mini로 transfer을 하는것이랑 차이점이 정확히 무엇인지 궁금합니다 
회원작성글 오이가싫어  |  11.28
Q. western할때 transfer 이 두판밖에 안됩니다 ㅠ
우선 gel은 4개 만들어놓으려고 하는데 러닝 기계는 한번에 4개가 돼서 가능하면 러닝 4개 하고  트랜스퍼를 2개씩 나눠서 하는 방법은 없을까요?  
회원작성글 dbkorea  |  11.28
Q. 항체 species reactivity
1차 항체를 샀는데 reactivity가 human입니다. 그럼 mouse protein에는 아예 붙지 않는건가요?
회원작성글 별헤는밥  |  11.28
Q. 미토콘드리아로의 전위 관련 해석이 안됩니다ㅠ 첨부파일
제가 가지고 있는 단백질의 서열에서 미토콘드리아로의 transmit을 해주는 서열이 있는지 확인하기 위해서 구글에서 찾아진 예측 프로그램을 돌려보았습니다! 아래 사진같은 결과가 나온다면, GO-term: C: mitochondria outer membrane 을 보았을 때, outermembrane 쪽으로 가게 해주는 signal peptide가 있다고 해석해도 되는 것인가요?
회원작성글 jjnli  |  11.27
Q. 안녕하세요 Lowry method의 보완법을 고안하던 중 질문 드립니다.
안녕하세요. lowry assay를 진행 후 궁금한 점이 있어 질문드립니다.   제가 찾아본 바로는 bradford assay의 경우 낮은 pH에서 단백질을 펼쳐 정확한 흡광도를 얻으려 한다 확인했습니다.   그럼 Lowry assay를 진행할 때 단백질에 SDS를 활용하여 단백질을 펼친다면 더 정확한 결과가 나오는지 궁금하여 질문 남깁니다! 추가로 SDS-page를 보면 95~100도로 가열하는데, 만약 위의 방법을 쓴다면 가열하지 않고도 SDS를 이용해 단백질을 필 수 있는지, 또 가열을 하게 된다면 단백질 정량에 문제가 없는지 알고 싶습니다.  답변 주셔서 감사합니다.
회원작성글 점보아몬드  |  11.27
Q. 단백질 정제(protein purification), SDS-PAGE 결과 첨부파일
marker/pellet/sup/ub/wash/imidazole200/imidazole400 순으로 sds-page 를 달렸는데, 단백질 발현이 제대로 나타나지 않은 이유가 뭔가요?
회원작성글 vitto  |  11.26
Q. Western blot blocking
안녕하세요 4학년 학부생입니다.. Western blot 실험 중인데 트랜스퍼 완료 후 워시까지 진행하였습니다.. 그런데..!!!! Skinmilk로 블락킹을 안하고 바로 1차 안티바디를 붙여서 상온에서 2시간 진행중에 있습니다… 그대로 진행해도 괜찮을까요..? 아니면 wash 하고 다시 블락킹 먼저 할까요..? ㅠㅠ
회원작성글 Dvs  |  11.25
Q. protein 농도 만들기
human recombinant IFN-γ와 같은 protein을 사서 실험을 하려고 할때 사진에서처럼 농도(20ng/ml, 767U/ml 등등) 이렇게 만드려면 계산을 어떻게 해서 만들어야 하나요?ㅠㅠㅠ 1mg으로 오면 이걸 1ml에 녹여서 1mg/ml로 만들고 희석하면 ng/ml로 만드는게 맞나요? 근데 U/ml은 어떻게 할지 모르겠어요...unit?정보도 안나와있고
회원작성글 개똥이야  |  11.25
Q. SDS-PAGE 밴드 휘어짐
최근 한달 사이에 PAGE를 내리면 두번째 사진처럼 양 끝쪽 밴드들이 더 많이 내려가 ∩ 모양으로 결과가 나오고 있습니다. 젤 퍼센트도 같거나 비슷하고, 버퍼도 동일하고, 러닝할 때 전압과 시간도 동일합니다. 유일하게 달라진 건 샘플버퍼를 새로 만들어서 썼다는건데 혹시 샘플버퍼 때문에 이런 문제가 생길 수 있나요? 체감상 샘플버퍼 바꾼 이후로 이런 문제가 생기는 것 같긴 하네요   정상일 때. 두달전까지만 해도 전부 이런식으로 잘 내려왔어요 최근에는 다 이렇게 양 끝이 휘어서 내려오고 있습니다  
회원작성글 ckk  |  11.25
Q. (그래프 있음, 질문 2개) 정량 곡선인 Standard curve 그렸을 때의 농도끼리 간격에 대한 질문이요. 첨부파일
질문 1) standard curve를 그렸을 때, 데이터가 너무 멀리 떨어져 있으면 좋지 않다고 하는데요. 그 이유를 모르겠어요. 질문 2) 예전에 R²값이 0.99 이상 되지 않았을 때, 데이터 1개를 빼서 0.99 이상으로 만들었었는데 모든 Standard 값이 다 들어간 상태로 정량해야 한다고 했었고요. 0.99 이상으로 만들기만 하면 되는 것이 아닌가요? 답변 부탁드립니다. 감사합니다.
회원작성글 아스널  |  11.24
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