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BioLab 박소정 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein
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Q. IHC 실험 중
IHC과정 중에서 primary Ab를 dilution 할 때 1% BSA가 들어간 PBS-T랑 해야하는데 5% BSA PBS-T와 dilution 했습니다... 이런 경험 있으신 분 있을까요..Secondary Ab도 똑같은 5%에 dilution 해서 넣어야할지 고민입니다...
회원작성글 Luminous  |  12.06
Q. 단백질 정량 값 변화 첨부파일
BCA를 통해서 흡광도를 측정해 단백질 정량을 하였습니다. 같은 샘플 2개(1차에서 2개 2차에서도 2개), 동일한 양일때 조건을 다시 한건 2차 측정시 샘플을 좀 더 많이 파이펫팅으로 풀어주었습니다. 그럴경우 좀 더 흡광도 값이 높게 나와 단백질이 많이 있다고 판단 할수도 있나요? 원래 파이펫팅으로 이렇게 값이 크게 변하는지도 궁금합니다. 
회원작성글 ouoo  |  12.04
Q. westernblot membrane이 왜이럴까요? ㅠㅠㅠㅠ제발도와주세여....
안녕하세요 westernblot 하는데 사진처럼 membrane이 자꾸 어둡게 나와서 뭐가 문제인지 모르겠습니다 ㅠ b-actin은 계속 잘나오는데 나머지Ab들이 자꾸 안나옵니다. 원래 blocking 시간은 1시간, RT 했는데 이번엔 2시간 했고, 1차Ab 농도도 1:1000했는데 1:800으로 늘렸구요, 4도씨 콜드룸에서 O/N했습니다.  워싱은 TBST이용하는데, 짧게 자주 교체해주라고 하시는 분이 계셔서 원래는 10분씩 3회 하는데 8분씩 5회 했고, rpm 도 더 세게 늘렸습니다.  2nd Ab는 원래 1:5000에서 1:10000으로 낮췄습니다. 아, 2nd Ab 하기 전에 re-blocking이 불필요한 detection 없애준다고 해서 10분정도 blocking 했구요. 그러고 나서 8분 5회 워싱 후 LAS 촬영했습니다. 도대체 뭐가 문제인지 모르겠습니다. 심지어.. 이번엔 IL-10이 그 전에는 membrane어둡고 멀티밴드가 나왔는데,  이번에 촬영해보니 군데군데 구멍도 나있고 두번째 membrane에는 그을린 것 같이 일부가 없어져서 나왔더군요... 사진마다 2개의 membrane 중 위의 것끼리는 같은 membrane이고 아래의 것 끼리는 같은 membrane입니다만, 다른 membrane은 다 괜찮은데 IL10은 왜 저런 구멍이 난걸까요 ㅜ membrane 어두운것, 멀티밴드, IL10의 밴드 손상 제발 도와주세요 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 
회원작성글 dbkorea  |  12.03
Q. western blot 시 멤브레인 전체가 흐릿하게 나옵니다..
안녕하세요, western blot 실험을 갓 배워서 이번이 세번째 실험인 초보입니다.. 아래 사진은 맨 처음 실험했을 당시 b-actin에 대한 결과인데, total protein의 농도가 40ug가 되도록 loading해주었습니다. 그런데 밴드가 일정하게 뜨지 않고 진하기가 다 다르게 뜨더라구요. 이 부분은 제가 초보라 정량하는 과정에서 실수가 있었을 수도 있겠구나 생각했습니다. 적어도 이 때는 membrane이 타지도 않았고, reference gene의 expression 정도가 다르게 나타날지언정 background도 뜨지 않아서 정량을 다시 잘 해서 재실험하면 잘 나오지 않을까 막연하게 생각했었습니다. 그런데 2, 3번째 실험을 했을 때는 아래 사진처럼 밴드가 전체적으로 너무 흐릿하게 나오더라구요.. total protein 농도는 똑같이 40ug로 맞춰주었습니다. 넣어주는 protien의 양 자체가 너무 작아서 그런건가 싶어서 찾아보았는데, 다른건 몰라도 b-actin의 경우 보통 50ug 정도면 충분히 잘 나올만한 양이라고 하는것 같아서요..ㅠㅠ 그리고 첫번째 실험했을 때랑 농도도 같은데 왜 이렇게 흐리게 나오는지 모르겠어요. Background도 심한것 같고.. 아 blocking은 3% BSA로 상온에서 한시간 해주었습니다.     제 스스로 조금 걸리는 부분은 Running buffer & transfer buffer를 재사용한 것인데, 제가 실험을 처음 배웠을 때 running buffer와 transfer buffer를 5번까지 재상용한다고 배워서 그렇게 진행했었습니다. 위의 사진은 두 buffer 모두 딱 5번째 재사용한 상태이구요. 그런데 결과가 잘 안나와 찾아보니 buffer를 재사용하지 말라는 말도 많더라구요.. 그리고 1st, 2nd Ab도 재사용하였습니다. 제가 배울때 6개월이 지나지 않은 상황에서는 닳아없어질때까지 써도 된다고 배워서.. 거의 8번정도 재사용한 상황입니다.  그 외에 실험 조건을 적어보면 SDS-PAGE (Running buffer 재사용/5번) - 8% gel - 70V, 0.2A, 300W로 전기영동 15분 (전압 고정) - 100V, 0.2A, 300W로 전기영동 약 한시간 (전압 고정) Transfer (Transfer buffer 재사용/5번) - 얼음 위에서 진행 - 110V, 0.25A, 200W로 2시간 20분 Blocking - 3% BSA로 상온에서 한시간 항체 붙이기& wash - 유리판 위에 membrane 올려두고 1st Ab (1: 1000 희석) 뿌려준 후 먼지 들어가지 않도록 덮어주고 4도에서 overnight - TBST로 5분간 3번 wash - 2차항체 (1:5000 희석) 뿌려준 후 상온에서 한시간 rocking - TBST로 10분간 3번 wash   ECL solution A, B 1:1로 섞어준 후 뿌려주고, 킴텍으로 충분히 제거 후 필름으로 덮어주고 케미닥 찍음   중간중간 조금 생략한 과정도 있지만 대략적으로 이렇게 진행하였습니다. 긴 글 읽어주셔서 감사하고, 많은 지도 부탁드립니다.ㅠㅠ 감사합니다!
회원작성글 천행  |  12.02
Q. HCP ELISA assay
안녕하세요. HCP ELISA assay에 대하여 시험법 개선을 수행하고 있습니다. method를 전반적으로 수정하는 것이 아니라 sample 제조 방법에 대해서 minor하게 수정하려고 하고 있으며, 결과 값의 %CV를 이용해서 variation이 적은 방법을 선택하고자 합니다.   해당 실험을 duplicate로 3set 실험해서 결과값을 내려고 했는데요 보통 MQ에서 precision이나 repeatability를 고려하면 6set~9set 정도 실험을 해야하나 해서요..어느 것이 guideline에 좀 더 적합할까요? 그리고 이런 minor 변경에 대해서도 guideline에 따라서 변경을 해야하나요?
회원작성글 624039  |  12.02
Q. western blot 실허 관련 질문 있습니다 !
학부생인데 1차항체 2차항체 붙이는 과정이 잘 이해가 안가서 질문 드립니다 ㅠㅠ    1차항체를 처리- washing - 2차항체 처리 하는 과정에서 중간 washing 과정 관련해 의문이 들었는데요. 2차항체가 1차항체를 확인하기 위해 붙이는 것으로 알고있는데 washing 과정을 거치게되면 1차항체가 제거될텐데 왜 washing을 하는건가요??
회원작성글 대하권진학예정  |  12.01
Q. western house keeping protein
galectin-1이라는 단백질을 transfection 시킨 후, single cell cloning을 거쳐 여러개의 clone을 얻어 gal-1 발현률을 비교해보고 있는데 house keeping 단백질이 계속 흔들립니다.   b-actin도 써보고 a-tublin도 써보는데,  둘다, gal-1이 많이 높게 발현되는 clone에서 그 발현양이 매우 낮습니다.   일단, QPCR로 확인을 하긴 할건데 이 clone들이 다른 유전자가 KO 된 것에 OE를 시킨 것이라 두 유전자의 영향이 있을 수는 있을 것 같긴한데 GAPDH를 써서 한 번 더 해봐야하나  고민 중입니다   comment를 부탁드립니다.
회원작성글 새슬  |  11.30
Q. SDS-PAGE 끌림현상(reducing Vs non-reducing)
안녕하세요!   단백질을 SDS-PAGE로 확인하고 있고, complex 형태를 이루는 부분이 있기 때문에 reducing과 non-reducing 샘플을 항상 비교하고 있습니다. Column work을 한 후에 보고 있는데, 최근 affininty 후에 샘플에서 끌림현상이 확인되고 있습니다. 정확하게는 affinity column 후, reducing과 non-reducing 샘플을 1개의 pre-made(commercial gel) gel에 loading을 하는데, 'non-reducing' 샘플에서만 끌림 현상이 확인되고, reducing 샘플은 깨끗하게 나오고 있습니다.  혹시 어떤 원인이 있을지 궁금합니다. 답변 주신 분들게 미리 감사 인사 드립니다.
회원작성글 sein  |  11.30
Q. Western blot band 질문 첨부파일
RAW 264.7 cell에 단백질로 p-p65등을 western blot으로 보려고 합니다. 근데 화면 지지직 거리는 그런 화면같이 나오거나 crop 밴드 형태만 나오고 band가 안나옵니다. 뭐가 문제인지 모르겠어요. 캐미닥을 쓰고 있고 blocking solution은 Ez blockchmi 쓰고 있고 transfer도 blocking과 같은 브랜드 제품 쓰고 있습니다 고수님들 도와주세요ㅠ 오늘안으로 알아야 되서요ㅠㅠ 급합니다
회원작성글 ono  |  11.30
Q. SDS-PAGE gel 유리판
SDS-PAGE gel 만들때 뒤의 short plate는 철로 된것이고, 앞은 유리로 된거 사용하는데 강하게 나사로 고정하면 유리가 깨지고 약하게 고정하면 젤이 굳기전에 흘러서 만들기가 참 어렵네요. 유리판을 써야하는 이유가 있나요? 플라스틱판이나 아크릴판을 적정크기로 잘라서 유리판대신 사용해서 젤 런하면 안되나요? 플라스틱판은 원래 없는건가요? 감사합니다.
회원작성글 BBlue  |  11.30
Q. ip 실험에 관하여 질문이 있습니다~.
안녕하세요, 요즘 ip실험을 하고 있는 석사생입니다. 저가 ip에 사용하는 비드가 Pierce Protein A/G Magnetic Beads  을 사용하고 있습니다. 이 비드를 사용하시는 분들 중 프로토콜 대로 pH을 이용하여 Elution하는것이 더 효율적인지 아님 2x sample buffer을 바로 넣고 70'c에 끓여서 하는것이 더 효율적인지 좋은 결과가 있는 경험이 있는 분들의 조언이 있으면 합니다.  
회원작성글 genesis  |  11.30
Q. western할때 membrane이 b-actin은 잘 나오는데 나머진 다 너무 어둡습니다 ㅠ 첨부파일
첨부한 사진처럼 b-actin은 그래도 membrane이 괜찮은데 나머지 ab들은 모두 il-10처럼 membrane이 어둡습니다. 1차 ab는 4도씨 12hr 이상 붙였고 그 후에 워싱 10분x3회 2nd ab 1hr 30min 워싱 10분x3회 그 후에 las 촬영했습니다. 대학원생때 이렇게 줄곧 해온 방법이라 왜 이러는지 모르겠습니다. 지금은 las 촬영때문에 ECL 처리 했던 것을 TBST에 넣어두고 있는데 워싱을 좀 더 하면 될까요? ㅠㅠ
회원작성글 dbkorea  |  11.29
Q. semi-dry transfer
Bio-rad 제품 semi-dry transfer 기계를 사용하는데, 저는 여기서 0.45 uM의 PVDF를 씁니다. 혹시 mini와 midi의 차이점이 정확히 뭔지 궁금합니다 ㅜㅜ  저는 midi로 걸었는데 아무 이상 없이 잘 사용해왔는데 mini로 transfer을 하는것이랑 차이점이 정확히 무엇인지 궁금합니다 
회원작성글 오이가싫어  |  11.28
Q. western할때 transfer 이 두판밖에 안됩니다 ㅠ
우선 gel은 4개 만들어놓으려고 하는데 러닝 기계는 한번에 4개가 돼서 가능하면 러닝 4개 하고  트랜스퍼를 2개씩 나눠서 하는 방법은 없을까요?  
회원작성글 dbkorea  |  11.28
Q. 항체 species reactivity
1차 항체를 샀는데 reactivity가 human입니다. 그럼 mouse protein에는 아예 붙지 않는건가요?
회원작성글 별헤는밥  |  11.28
Q. 미토콘드리아로의 전위 관련 해석이 안됩니다ㅠ 첨부파일
제가 가지고 있는 단백질의 서열에서 미토콘드리아로의 transmit을 해주는 서열이 있는지 확인하기 위해서 구글에서 찾아진 예측 프로그램을 돌려보았습니다! 아래 사진같은 결과가 나온다면, GO-term: C: mitochondria outer membrane 을 보았을 때, outermembrane 쪽으로 가게 해주는 signal peptide가 있다고 해석해도 되는 것인가요?
회원작성글 jjnli  |  11.27
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