안녕하세요. 면역 논문 읽고 있는 대학생입니다. western blot을 할 때 HA tag을 사용 하는 이유가 뭔가요? tag를 하면 detect를 판단하기 쉬워서 라는데 이게 맞나요? 그리고 저 HA의 띠는 그냥 beta-actin처럼 control로 판단하면 되나요?   또 Src가 phosphorylation이 되면 IkB를 phosphorylation하고 따라서 NF-kB가 활성화 되는 것이 맞는지 궁금합니다.

안녕하세요, 요즘 immunofluorescence 실험을 시작하고 있는 대학원생입니다.  제가 IF 실험을 처음 하고 있는데, staining한 후에 confocal 현미경으로 관찰 시 protein을 구분할 수 없을 정도로 background signal이 많이 검출되어 프로토콜 상의 무엇이 문제일지 잘 모르겠어서 질문 올리게 되었습니다.    현재 저는 cytosolic protein인 guanylate binding protein (GBP)을 staining하는 것이 목표입니다.  전반적인 실험 과정은  1. fixation: 4% PFA로 15분간 RT에서 incubation 시킵니다.  2. Permeabilization: 0.1% PBST (0.1% Triton X-100 in PBS)로 10분간 incubation 시킵니다.   3. Blocking: 5% goat serum이 함유된 0.1% PBST로 40분간 incubation 시킵니다.  4. Staining: 1% goat serum이 함유된 PBS에 첫번째 antibody를 1:200으로 희석하여 4도에서 overnight 시킵니다. 그 후 두번째 antibody (color)를 1:400으로 희석시켜 1시간동안 RT에서 incubation 시킵니다.  5. Nuclear counterstaining and mounting: Antifade DAPI solution으로 5분간 RT에서 incubation 시킨 뒤 바로 이미징합니다.    현재 첫번째 antibody는 Santa Cruz사의 GBP1-5 antibody (sc-166960)을 사용하고 있으며 두번째 antibody는 invitrogen사의 Goat anti-mouse IgG (H+L), AF488 사용중입니다.    두번째 antibody만 넣은 control 및 첫번째 antibody 대신 isotype을 넣은 control을 걸어 확인해본 결과에서는 staining이 훨씬 안 되는 것을 확인하였고 프로토콜 과정 중 PFA 농도 및 처리 시간, blocking 과정에서 PBST의 농도는 변경해서 진행해보았지만 비슷한 결과가 나오는 것으로 보아 이 문제는 아닐 것 같다는 생각이 듭니다.  혹시 어떤 과정에서 이미지 상 background signal의 문제점이 나타나는 것일지, 제가 놓친 부분은 없는지 말씀해주시면 감사하겠습니다. 제가 staining한 이미지 파일 첨부드리겠습니다,   감사합니다. 

안녕하세요, brain tissue로 IF staining 중인 석사생 입니다.  실험 과정에서 다음과 같은 문제가 발생하여 조언을 얻고 싶어, 글 작성 합니다. -Brain frozen section IF staining     1. DAPI, 2. GFAP, 3. DAPI+GFAP 1) Background가 너무 심하게 나옵니다.. DAPI, secondary antibody가 과하게 염색되어 그런 것일까요? IF staining 시 background가 발생하는 이유에 대해 여쭤보고 싶습니다..  -PAP pen을 사용하는데.. 이것때문에 wash가 안 되어서 그런 것일까요? wash할때, 슬라이드를 세워서 툭툭 털고 pbs 분주 후 5분 뒤, 다시 세워서 툭툭 털어내는 방식으로 진행하고 있습니다. -antibody    2)GFAP의 background를 조절하면, 일부 샘플에서 DAPI가 사진처럼 저렇게 보이고는 합니다.. 왜 그런 것일까요?   3)그림에서 처럼 brian 조직에 구멍이 뚫려 있습니다. (1)PBS(20ml)->4%PFA(15ml) perfusion (2)4%PFA로 O/N (3)15%sucrose (12h) -> 30%sucrose (O/N) 완전히 가라앉을 때까지 (4)OCT compound에 embedding 후 -80도에 보관 (5)section 두께 10um, slide에 바로 부착 후 -80도 보관 (6)staining 시, slide를 RT에서 30분 -> acetone (10min) -> PBS 5분 X2 이후 진행하였습니다. 찾아보니 -4%PFA로 선고정 후, 후고정으로 담가둘때 O/N 하지말고, 2-3시간만 담그기 -균일하게 자르기 등이 있었는데.. 이와 관련된 또는 이와 다른 조언이 있다면 듣고 싶습니다.   Fluorescent Immunohistochemistry (IHC) Frozen Protocol: Novus Biologicals의 프로토콜을 참고하여, 실험을 진행하였습니다.   위의 질문 외에 IF staining시의 조언이 있다고 요청 드립니다. 미리 감사합니다.

안녕하세요, 실험실에서 opal-multiplex staining 실험을 시작하게 되였습니다. 염색을 하고 scan하면 image가 깨끗하지 않아 보입니다.  혹시 primary antibody 농도가 높은 건가요? 아님 scan할때 expose time이 잘못 설정 된걸가요? 

1차항체 붙이고 원래 2차항체 붙인다음에  마지막에 Hochest (DAPI)처리했었는데 제 잘못으로 Hochest 먼저 처리했습니다 2차 Ab처리할때 문제가 되지는 않을까요? Detection되는 light는 당연히 다릅니다

mouse brain의 IHC staining을 준비 중인데, slide에 계속 말려 올라가서 free floating 방법으로 실험을 재계획 중입니다.. 질문은 다음과 같습니다. 1)cryopreservation solution을 찾아도 자세한 설명 없이, 'suitable for cryopreservation'이라고만 적혀 있어서요 ㅠㅠ 혹시 free floating시에, 조직을 보관하는 보존액,보관액과 관련된 정보를 주실 선생님 계실까요 ㅠㅠ 2)brain을 Slide에 바로 attach하고 있는데, 접히거나.. 아니면 OCT와 조직이 분리되는 현상이 생깁니다. 왜 그러는지, 해결법은 있는지 아시는 분 계실까요.. 3)free floating 방법 실행시 팁 얻고 싶습니다!!   많은 도움 부탁드립니다. 미리 감사합니다 : )

mouse whole brain을 '4% PFA -> 15% sucrose -> 30% sucrose' 후 OCT 하여 -80'c에 보관하였습니다.   이제 cryosection(24um)하여 슬라이드에 붙인 후 IHC-IF를 진행하려고 하는데.. 하여야 하는 IHC antibody 종류가 많다보니,  section 후에 slide 상태로 보관 후에 IHC를 진행하려고 합니다. 질문은 다음과 같습니다.   (1)아래와 같이 진행해도 괜찮을까요? 어떤 분은 slide에 올린 뒤 그냥 바로 -80'c에 넣어도 된다고 하시고,,, 조언부탁드립니다. 1) 자른 section을 slide에 올리기 2) PBS wash (5min X3) 3) Cold acetone (10min Fixation) -> 다 증발하면, deep freezer 보관     (2)보관 후 brain 붙은 slide 사용할때, 아래와 같이 사용하면 될까요..? #RT에 놔두고 온도 안정화 à PBS wash (5min X3) è PAP PEN è 4%PFA로 고정    (3)딥프리져에 slide 보관 후, 이후에 다시 사용할때  60도 dry oven에서 1시간 baking하고 사용하는 것이 좋다고 하는데.. 이것에 대한 의견도 궁금합니다.   바쁘신 시간 내어 글 읽어주셔서 감사합니다.

안녕하세요! immunofluorescence(IF) 실험을 셋팅중인 연구원입니다.   다름이 아니라 A라는 특정 물질을 처리한 후 세포에 잘 투과되었는지를  IF로 확인하려고 하고있는데요.   세포에 A 샘플을 처리하여 방치한 후 Fixation, permeabilization, blocking 과정을 거친 후 A primary antibody, primary에 해당하는 secondary antibody를  붙여서 진행했습니다.   실험과정에서는 크게 문제가 없어 보이는데 문제는 A 라는 샘플을 처리하지 않은 컨트롤에서도 A 단백질의 발현이 관찰되어 난황을 겪고있는 상황입니다.   컨트롤에서도 A단백질 발현이 관찰 되었다는 것은 A primary antibody가 세포에 붙었다고 생각이 되는데.. 그럼 세포 자체에서 A라는 단백질을 생산하거나 A primary antibody 결합부위와 맞는 유사한 단백질이 있다고 해석을 해야할까요?   A 물질 뿐만 아니라 다른 물질로 실험해도 계속 컨트롤에서 샘플 처리한 것과 비슷하게 발현이 관찰되어 고민 끝에 질문드립니다.   혹시 비슷한 경험을 해보신 분이 계시다면 도움 부탁드립니다.     1, 3번 Control / 2, 4번 Sample    

brain IHC staining을 준비 중 입니다. 1차 antibody와 2차 antibody를 정하는데 궁금한 것이 있어서 질문 남김니다.   first antibody: Ki-67 Monoclonal Antibody ((Host/isotype: Rat/IgG2a kappa) secondary antibody: Goat Anti-Rat IgG Antibody 이렇게 구매하고자 계획 중인데.. first antibody의 isotype은 IgG2a이고, secondary antibody는 IgG여서요...   구매하여 사용하여도 가능할까요?  아니면 IgG2a로 구매하여서 사용해야 할까요?   추가적으로 IgG2a와 IgG2b도 큰 차이가 나나요?   미리 답변 감사합니다 :)

immunofluorescence에 필요한 cell antibody를 찾고 있는데, 랩실에서 사용한 장비를 가지고 실험한 antibody가 찾아도 나오질 않습니다,, cell에 특이적으로 붙는 antibody도 없는 것 같은데 이럴 땐 어떠한 방식으로 찾아보아야 하는지 조언 부탁드립니다 ,,

안녕하세요. 이미지제이로 IHC 조직분석 시 두개의 signal 의 colocalization 된 정도를 확인하고 있습니다.    총 DAPI 수에서 두 시그널이 merge된 세포 수의 % 를 구하려고 합니다만, merge 된 signal 의 area 가 아닌 개수를 확인하는 방법을 모르겠습니다.   youtube, google 을 포함하여 다양한 매체로 확인해보았으나... 결국 글 남기게 됩니다. 읽어주셔서 감사합니다!

 면역형광법 실험 관련 논문 보는 중에 궁금한 것이 있어 질문드립니다  해당 figure 내용이 Further double immunofluorescence staining revealed that MyD88 was highly expressed in α-SMA+ myofibroblasts in the AOM/DSS model (Figure 1C) 인데 내용이 의하면 α-SMA의 발현이 높으면 myd88 발현도 높아지는 것으로 받아들여졌는데 figure에서는 aom/dss 처리 후 120days에 myd88의 발현은 점점 높아지는데 α-SMA 발현은 오히려 10days 보다 감소한 것이 아닌가요? 형광으로 염색되어 보이는 것을 발현 됐다고 해석하는게 맞는지 궁금합니다ㅜㅠ 

안녕하세요. H&E staining 의뢰를 맡기려고 합니다. Fixed tissue이며 paraffin block + section + stain 을 하려고 합니다. 서울지역이나 전북지역 대학 중 빠르고 추천해줄 곳이 있으시면 말씀부탁드립니다. 

두가지 primary 항체를 써서 각각 다른색으로 labeling하려고 하는데요, 만약에 다른 1차항체 두개가 같은 단백질에 결합할 수 있으면 두 색으로 모두 염색되는게 아니라 결합자리를 경쟁하게 되어서 하나의 색으로만 염색이 되는건가요?  예를들어,   1차항체 #1 (초록색): A단백질, B단백질   1차항체 #2 (빨간색): B단백질, C단백질 위와 같이 반응시키면, B단백질은 초록색/ 빨간색으로 둘 다 염색이 되는게 아니라 둘 중 하나의 색으로만 염색되는건가요...?

안녕하세요    최근들어 조직염색을 하고 있는 대학원생입니다.   조직을 염색하는데 프로토콜마다 좀 다른것같아서요..     파라핀 조직이고 deparaffin 하는건 알겠는데 (자일렌-알콜 고->저)   Dehydrate 할때 알콜 저->고농도 하고 자일렌하고 끝내는 것도 있고 (ex>H&E) 그냥 absolute alcohol 으로 끝내는 것도 있는데..(ex>sirius red) 이게 무슨 차이가 있는건지 궁금합니다.   DAB염색시 자일렌을 해주는게 좋은가요?(이것도 프로토콜마다 달라서..)     그저 키트마다 다른건지.. 마지막에 자일렌을 무조건 해주는게 좋은건지 궁금합니다.   그리고 absolute alcohol으로 끝냈을때 마운팅은 지용성으로 해야하는지 수용성으로 해야하는지도 궁금해요...         감사합니다!

현미경에서 동물조직을 찍을때, DAPI와 594 red signal을 확인을 해야하는데요. 컨트롤(약물을 처리하지 않은 샘플)을 우선 찍으려고 아이스피스로 봤을때 잘보이는데, 현미경컴퓨터상에서는 흐리게 보여 레이저 파워를 조절한다면, 그 다음 대조군(약물처리한 샘플)에서는 DAPI 레이저 조절를 하면 안되는건가요? 차이를 비교하려면 어떻게 조건을 잡아야하는지 궁금합니다. ㅠㅠ 초보라 많이 어렵네요