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 카테고리: 전체 > Immunology > Immunofluorescence
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Q. brain OCT section slide 보관법
mouse whole brain을 '4% PFA -> 15% sucrose -> 30% sucrose' 후 OCT 하여 -80'c에 보관하였습니다.   이제 cryosection(24um)하여 슬라이드에 붙인 후 IHC-IF를 진행하려고 하는데.. 하여야 하는 IHC antibody 종류가 많다보니,  section 후에 slide 상태로 보관 후에 IHC를 진행하려고 합니다. 질문은 다음과 같습니다.   (1)아래와 같이 진행해도 괜찮을까요? 어떤 분은 slide에 올린 뒤 그냥 바로 -80'c에 넣어도 된다고 하시고,,, 조언부탁드립니다. 1) 자른 section을 slide에 올리기 2) PBS wash (5min X3) 3) Cold acetone (10min Fixation) -> 다 증발하면, deep freezer 보관     (2)보관 후 brain 붙은 slide 사용할때, 아래와 같이 사용하면 될까요..? #RT에 놔두고 온도 안정화 à PBS wash (5min X3) è PAP PEN è 4%PFA로 고정    (3)딥프리져에 slide 보관 후, 이후에 다시 사용할때  60도 dry oven에서 1시간 baking하고 사용하는 것이 좋다고 하는데.. 이것에 대한 의견도 궁금합니다.   바쁘신 시간 내어 글 읽어주셔서 감사합니다.
회원작성글 척척석사_  |  02.02
Q. immunofluorescence 컨트롤 발현
안녕하세요! immunofluorescence(IF) 실험을 셋팅중인 연구원입니다.   다름이 아니라 A라는 특정 물질을 처리한 후 세포에 잘 투과되었는지를  IF로 확인하려고 하고있는데요.   세포에 A 샘플을 처리하여 방치한 후 Fixation, permeabilization, blocking 과정을 거친 후 A primary antibody, primary에 해당하는 secondary antibody를  붙여서 진행했습니다.   실험과정에서는 크게 문제가 없어 보이는데 문제는 A 라는 샘플을 처리하지 않은 컨트롤에서도 A 단백질의 발현이 관찰되어 난황을 겪고있는 상황입니다.   컨트롤에서도 A단백질 발현이 관찰 되었다는 것은 A primary antibody가 세포에 붙었다고 생각이 되는데.. 그럼 세포 자체에서 A라는 단백질을 생산하거나 A primary antibody 결합부위와 맞는 유사한 단백질이 있다고 해석을 해야할까요?   A 물질 뿐만 아니라 다른 물질로 실험해도 계속 컨트롤에서 샘플 처리한 것과 비슷하게 발현이 관찰되어 고민 끝에 질문드립니다.   혹시 비슷한 경험을 해보신 분이 계시다면 도움 부탁드립니다.     1, 3번 Control / 2, 4번 Sample    
회원작성글 s_s  |  01.20
Q. IHC 1,2차 antibody isotype(동형)
brain IHC staining을 준비 중 입니다. 1차 antibody와 2차 antibody를 정하는데 궁금한 것이 있어서 질문 남김니다.   first antibody: Ki-67 Monoclonal Antibody ((Host/isotype: Rat/IgG2a kappa) secondary antibody: Goat Anti-Rat IgG Antibody 이렇게 구매하고자 계획 중인데.. first antibody의 isotype은 IgG2a이고, secondary antibody는 IgG여서요...   구매하여 사용하여도 가능할까요?  아니면 IgG2a로 구매하여서 사용해야 할까요?   추가적으로 IgG2a와 IgG2b도 큰 차이가 나나요?   미리 답변 감사합니다 :)
회원작성글 척척석사_  |  01.03
Q. antibody
immunofluorescence에 필요한 cell antibody를 찾고 있는데, 랩실에서 사용한 장비를 가지고 실험한 antibody가 찾아도 나오질 않습니다,, cell에 특이적으로 붙는 antibody도 없는 것 같은데 이럴 땐 어떠한 방식으로 찾아보아야 하는지 조언 부탁드립니다 ,,
회원작성글 dkaneh  |  2022.12.31
Q. imagej 로 IHC 조직분석시 Colocalized signal "개수" 확인요령
안녕하세요. 이미지제이로 IHC 조직분석 시 두개의 signal 의 colocalization 된 정도를 확인하고 있습니다.    총 DAPI 수에서 두 시그널이 merge된 세포 수의 % 를 구하려고 합니다만, merge 된 signal 의 area 가 아닌 개수를 확인하는 방법을 모르겠습니다.   youtube, google 을 포함하여 다양한 매체로 확인해보았으나... 결국 글 남기게 됩니다. 읽어주셔서 감사합니다!
회원작성글 nararaJian  |  2022.12.27
Q. immunofluorescence 논문 내용 중 해석 질문드립니다
 면역형광법 실험 관련 논문 보는 중에 궁금한 것이 있어 질문드립니다  해당 figure 내용이 Further double immunofluorescence staining revealed that MyD88 was highly expressed in α-SMA+ myofibroblasts in the AOM/DSS model (Figure 1C) 인데 내용이 의하면 α-SMA의 발현이 높으면 myd88 발현도 높아지는 것으로 받아들여졌는데 figure에서는 aom/dss 처리 후 120days에 myd88의 발현은 점점 높아지는데 α-SMA 발현은 오히려 10days 보다 감소한 것이 아닌가요? 형광으로 염색되어 보이는 것을 발현 됐다고 해석하는게 맞는지 궁금합니다ㅜㅠ 
회원작성글 rlatmddus  |  2022.12.13
Q. H&E Staining 의뢰
안녕하세요. H&E staining 의뢰를 맡기려고 합니다. Fixed tissue이며 paraffin block + section + stain 을 하려고 합니다. 서울지역이나 전북지역 대학 중 빠르고 추천해줄 곳이 있으시면 말씀부탁드립니다. 
회원작성글 분자생물왕  |  2022.12.12
Q. IF double staining 관련 질문
두가지 primary 항체를 써서 각각 다른색으로 labeling하려고 하는데요, 만약에 다른 1차항체 두개가 같은 단백질에 결합할 수 있으면 두 색으로 모두 염색되는게 아니라 결합자리를 경쟁하게 되어서 하나의 색으로만 염색이 되는건가요?  예를들어,   1차항체 #1 (초록색): A단백질, B단백질   1차항체 #2 (빨간색): B단백질, C단백질 위와 같이 반응시키면, B단백질은 초록색/ 빨간색으로 둘 다 염색이 되는게 아니라 둘 중 하나의 색으로만 염색되는건가요...?
회원작성글 snkd  |  2022.11.29
Q. IHC .. Dehydrate 질문드립니다.
안녕하세요    최근들어 조직염색을 하고 있는 대학원생입니다.   조직을 염색하는데 프로토콜마다 좀 다른것같아서요..     파라핀 조직이고 deparaffin 하는건 알겠는데 (자일렌-알콜 고->저)   Dehydrate 할때 알콜 저->고농도 하고 자일렌하고 끝내는 것도 있고 (ex>H&E) 그냥 absolute alcohol 으로 끝내는 것도 있는데..(ex>sirius red) 이게 무슨 차이가 있는건지 궁금합니다.   DAB염색시 자일렌을 해주는게 좋은가요?(이것도 프로토콜마다 달라서..)     그저 키트마다 다른건지.. 마지막에 자일렌을 무조건 해주는게 좋은건지 궁금합니다.   그리고 absolute alcohol으로 끝냈을때 마운팅은 지용성으로 해야하는지 수용성으로 해야하는지도 궁금해요...         감사합니다!
회원작성글 찌랭이  |  2022.11.28
Q. 현미경 으로 동물조직을찍을때
현미경에서 동물조직을 찍을때, DAPI와 594 red signal을 확인을 해야하는데요. 컨트롤(약물을 처리하지 않은 샘플)을 우선 찍으려고 아이스피스로 봤을때 잘보이는데, 현미경컴퓨터상에서는 흐리게 보여 레이저 파워를 조절한다면, 그 다음 대조군(약물처리한 샘플)에서는 DAPI 레이저 조절를 하면 안되는건가요? 차이를 비교하려면 어떻게 조건을 잡아야하는지 궁금합니다. ㅠㅠ 초보라 많이 어렵네요
회원작성글 초코파티  |  2022.11.25
Q. IF permeabilization 생략?
IF에서 membrane protein & intracellular protein을 둘다 labeling하는 항체를 사용하려고 하는데요. 너무 강하게(?) permeabilization하면 membraine protein이 망가질 우려가 있지 않을까 싶어서 검색하다가  antibody dilution을 PBS-Trition으로 하니까 permeabilization 과정을 생략하는 사람도 있는 것 같아서요. 혹시 이렇게 해보신 분 계신가요?  아니면 membrane protein & intracellular protein 동시에 labeling하신 분 어떻게 진행하셨는지 여쭤보고 싶습니다. 
회원작성글 enedd  |  2022.11.22
Q. 면역형광염색 IF 1차, 2차항체 확인 부탁드립니다 + 관련질문
3종류의 다른 단백질의 발현을 확인하고 싶어서 triple로 IF를 진행하려고 합니다.  처음 해보는거라 불안한데 물어볼 선배가 없어서요ㅠㅠ 도움 부탁드려요.   <primary antibody> 1. Mouse 유래 2. Rabbit 유래 3. Gout 유래   <secondary antibody> 1. Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 2. Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 3. Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 647   + 추가적으로 질문드립니다. 위와 같이 염색진행 후, 동일한 sample에서의 ER이나 mitochondria와 같은 subcellular 구조를 염색해서 단백질 위치를 확인하려고 합니다.  연구실 항체리스트를 보니까 subcellular marker의 primary antibody가 전부 rabbit 유래인데, 위의 2번째 단백질 primary antibody를 rabbit 유래를 썼는데 또 다음 염색에서 동일한 host꺼를 사용해도 되는지 궁금해서요ㅜㅜ 사용해도 된다면, secondary antibody 선택 시 alexa 488, 594, 647을 제외한 색의 anti-rabbit 항체를 선택하면 되나요?
회원작성글 세포실험초보입니당  |  2022.11.18
Q. alkaline phosphatase 조직 염색!? 첨부파일
hair dermal papilla 부분 stemness 확인 위해 마우스 피부 조직 cryomold sample을 ALP 염색해 볼 예정입니다. 1. EC나 골세포 ICC외에, 조직 염색 방법은 찾아봤을 때 많이 없어서 과정을 여쭙 싶습니다. 밑의 과정이 맞는지 확인해주시면 감사하겠습니다. PBS wash --> NBT/BCIP sol. add 15min in dark (파랑색 띄면 멈춤) --> PBS wash --> mounting 2. ALP 염색 자체는 조직이 본래 가지고 있는 효소를 염색하는 것이라, 따로 항체(ex)anti-ALP antibody)를 붙여줄 필요 없나요? NBT/BCIP sol.이 발색제 용도인건 알겠으나, 다른 여러 프로토콜들에 only substrate를 첨가한다고 하지 따로 1차 항체를 붙여준 다는 내용이 없어 궁금합니다. 3. SIGMAFAST™ BCIP®/NBT(B5655)를 사용해 염색해 볼 예정인데 첨부해놓은 데이터시트지에서 보시다시피, 과정 자체가 블롯용이라 IHC에 참고하기는 어려워보이는데 1.기입해놓은 과정으로 진행하면 될까요..   도움주시면 정말 감사하겠습니다..!
회원작성글 12312  |  2022.10.17
Q. mouse 조직면역염색 4color 관련
안녕하세요.  저는 mouse 조직으로 면역염색을 하려는 대학원생입니다. 다름이 아니라 antibody 구입하려고하는데 dapi 포함 4color 염색 조합을 찾는게 매우 어렵네요... A,B,C,DAPI 염색을 한다고했을때 A- 2차 goat anti-rabbit 488 B- 2차 goat anti-rat 594 C- 2차 goat anti-mouse 647 ->>>>>>> 여기가 문제..   로 단순하게 생각했는데 mouse 조직이다 보니 2차 host가 mouse 인 antibody가 없더라구요.... 이런경우는 어떻게해야 4 color를 염색할 수 있을까요?   ㅠㅠㅠ    노하우 공유부탁드립니다.
회원작성글 신경생물  |  2022.10.05
Q. CMV culture urine검체 양성 첨부파일
안녕하세요 전에 검사들 토대로 culture 배양시켜서 눈에 익히려구 공부를 하고있는데 urine 검체로 배양시켜본 검체가 양성인지 여쭙고 싶습니다 다른 양성 검체들과는 세포가 배양된 모양이나 양상이 다르게 나와서 너무 헷갈리네요ㅠㅠ 다른 검체들은 셀 크기도 확실히 더 크고 모양도 돼지코 모양으로 딱 이쁘게 나오는데 혹시 왜 다른 검체와 양상이 다른지도 아시는분이 계시다면 가르쳐 주셨으면 합니다 저배율로 보다가 찌꺼기인지 구분이 어려워 고배율로 최대 확대했는데 양성인걸까요?
회원작성글 pink1048  |  2022.09.30
Q. IHC 조직 두께 관련
안녕하세요!   MOUSE brain 을 30~40um 두께로 cryosection 하여 형광 염색을 할 예정입니다.  free floating 기법으로 염색을 할 예정이며 confocal로 사진 찍을 예정인데, 30~40um 두께로 잘라도 confocal에서 초점이 잘 잡히고 사진이 잘 찍히는지 궁금합니다. 
회원작성글 졸려요  |  2022.09.22
Q. DC Maturation 후 FACS
안녕하세요  현재 BMDC maturation 실험 준비중인 학부연구생입니다. cell을 키운 후에 LPS 처리하여 FACS를 찍어보려고 하는데 compensation 이 무엇인지 잘 모르겠습니다.  positive와 negative를 걸어서 일종의 기준점?을 만드는 것 같은데 맞나요? plate design 시에 comp.well은 어떻게 design 해야하는건가요?실험군 수대로 맞추는건가요 아니면 처리하는 형광 수대로 design하는건가요? 참고로 형광은 PE와 PE-cy7을 사용합니다 아직 학부생이라 많이 부족합니다. 열심히 찾아보고 공부하는데도 잘 모르겠어서 질문올려요 도와주세요ㅠ
회원작성글 호구마  |  2022.09.08
Q. 세포에 형광염색할때
안녕하세요. 세포실험은 초짜인 대학원생입니다. 저는 mammalian cell에 bacteria를 처리한 후 약물처리를 해서, bacteria가 줄어드는 양상을 현미경으로 관찰하는 실험을 하고 싶습니다만... 저희 연구실에서 아무도 해본 적이 없고 저도 처음이라서 막막하여 글을 남깁니다. 1. 항체는 꼭 2차까지 처리를 해야하나요? 만약 Mammalian cell의 세포질을 타겟하는 형광이 붙은 antibody와 bacteira를 타겟하고 형광이 붙은 antibody가 존재한다면 그 두 개를 동시에 처리하고 바로 형광 현미경을 보아도 될까요?? 2. 찾아보니 Mounting용액에 DAPI가 섞인 제품도 있던데 ... mounting?? 봉입체?? 를 꼭 해주어야하는건가요? 그리고 mounting 용액에 DAPI가 들어간 것은 DAPI가 핵을 염색시키면 그 후에 추가 wash과정 없이 현미경을 보는 건가요? ㅠㅠ 초보라 질문이 많고 기본적인것일수도 있지만 아시는 분은 상세한 답변 부탁드리겠습니다.
회원작성글 와디와디  |  2022.08.03
Q. cytoflowmetry 분석 관련 질문입니다
안녕하세요, 늘 브릭을 통해 많은 도움을 받고 있습니다. 이번에 하고 있는 연구로 인해 외국 연구실에 교환학생을 오게 되었습니다. T cell 활성화 관련 실험을 진행하고 있는데요, cytoflowmetry 경험이 별로 없어서 첫주부터 진행이 막혔습니다ㅜㅜ 영어가 짧은 탓에 대혼란을 겪고 있습니다... 거두절미하고 질문을 드리자면, NFAT-GFP tag된 T cell을 live/dead cell stain 한 뒤 cytoflow 찍었습니다. 아래 데이터는 별도로 activation 시키지 않은 세포의 분석결과인데요.   보시면 GFP signal이 뜹니다. anti CD3/CD28 친 실험군이랑 별반 차이도 없어요. 바보같은 질문이지만 원래 항상 NFAT의 GFP가 뜨나요? 활성되었을 때만 뜨느 게 아닌가요?? 대체 뭐가 문제일까요...... 월요일에 교수님과 미팅인데 큰일났네요. 절박합니다...... 도움부탁드립니다 .... 감사합니다ㅜㅜ
회원작성글 9383  |  2022.07.30
Q. image J positive cell counting하는 방법 첨부파일
immunohistochemistry 데이터 분석 중인데,  total DAPI로 염색 된 세포 중에서 특정항체에 특이적으로 발현 된 (ex) KI67+ 세포들 만 Counting 하고 싶은데,  gray scale로 바꿔서 하자니 RFP, GFP 구분 없이 DAPI+ 포함 모든 세포가 잡혀서 counting하기가 힘들고 bit 전환없이 일일히 세자니 그 수가 너무 많고 전체 세포 대비 %를 구하기 힘들 것 같아 고민입니다. 논문들 보면 형광면염염색 figure와 함께 %막대그래프로 수치화한 figure를 함께 보여주던데, 딱히 method를 보아도 counting 방법은 나와있지 않네요ㅠ  
회원작성글 12312  |  2022.07.17
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