[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
머크
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
BioLab 박소정 교수
전체보기 안전점검 LABox
 카테고리: 전체 > Cell Biology > Transfection
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
Cell Biology Microbiology Plant Biology Laboratory Animals
Omics Chemical biology Bioinformatics Laboratory Equipments
Buffer/Reagent Bioethics Etc.
카테고리 전체보기펼치기
질문/투표/프로토콜 등록
Q. ES cell line lentiviral transduction 후 delay된 cell death
최근 embryonic stem cell 라인에 lentivirus를 이용하여 transduction을 시켜주는 실험을 하고 있습니다.  Infection으로부터 24시간 후 selection을 시작해주었고 세포는 몇 일 동안 잘 자라서 passaging도 한번 해주었습니다. 한 5-6일 정도는 selection drug이 포함된 미디엄에서 아무 문제 없이 잘 자란 것 같습니다. 그런데 갑작스럽게 massive한 cell death가 발생하기 시작했습니다. 세포가 자라기는 하는 것 같은데 그 속도와 비슷하게 (아니면 조금 더 빠르게?) 사멸하여 육안으로도 둥둥 떠있는 세포가 보일 정도입니다. 현미경 상으로 관찰하였을 때 컨탬처럼 보이는 부분은 없고, 죽은 셀만 제거해주면 바닥도 깔끔해보입니다 (mycoplasma 컨탬 검사는 안 해봤습니다). 이렇게 보면 바이러스의 문제인가 싶기도 하지만, 동일한 바이러스로 infection된 embryonic stem cell 다른 셀라인은 이상 없이 아주 잘 자라고 있어서 도대체 뭔가 싶습니다... 같은 embryonic stem cell이라도 셀라인마다 efficiency가 다를 수가 있나요? efficiency 문제라면 왜 cell death가 delay되서 나타나는지도 잘 모르겠습니다 (transduction 없이는 보통 selection 3일차에 90% 이상 사멸합니다).  작은 힌트라도 소중한 답변 주시면 정말 도움이 많이 될 것 같습니다...감사합니다!
회원작성글 BioMate  |  12.01
Q. Lipofectamine 이용 transfection시에
Lipofectamine 2000 이용해서 miRNA로 셀에transfection하려고 하는데 사용해야하는 비율이 어떻게 될까요? miRNA : lipo = 1:2 정도면 충분할까요?
회원작성글 팡이  |  11.21
Q. lentivirus 처리할 때, polybrene 2달 지난 것 사용했는데요. 문제가 있겠죠?
세포에 lentivirus 1 mL, 배지 1 mL을 넣고 10 mg/mL polybrene을 2 uL 넣고 인큐베이터에 넣고 퇴근했는데요. 생각해보니까 polybrene이 2달 지난거였어요. 지방 내려가야 해서 다른 사람한테 부탁하고 퇴근했는데요. 문제 발생할까요?ㅠㅠ 참고로 polybrene은 섭씨 -20도에 보관했었습니다.
회원작성글 아스널  |  11.18
Q. transfection관한 질문입니다!
HEK-293T cell line에 midiprep한 plasmid DNA를 transfection하고 luc은 luminometer로 확인하고 eGFP는 형광현미경으로 확인하는데요 luc은 발현이 잘 되는데 eGFP는 형광현미경으로 거의 안 보여서 eGFP도 lysis하고 형광파장에서 찍어봤는데 발현양이 luc에 절반도 안되더라고요 똑같은 조건에서 transfection했는데 이런 경험 있으신 분들 조언주시면 감사하겠습니다 주변에 물어볼 사람도 없어서 올려봅니다ㅜㅠ
회원작성글 Luminous  |  11.14
Q. MG1655에서 protein overexpression
안녕하세요, 벡터 관련해서 질문하고 싶습니다.   MG1655에서 mutant protein을 overexpression (혹은 그냥 expression)해야 하는 상황입니다. 단백질에는 His tag 가 달려 있게 sequence를 구성해야하고, 현재 pET21b vector 안에 sequence가 들어있는 plasmid로 BL21에서 발현시키고 있었습니다. IPTG를 사용하고 있어요.   1. 그런데 MG1655를 사용하게 되면 T7 promotor가 사용되는 pET vector는 사용하지 못할 것 같은데, 다른 vector가 뭐가 있을까요? 2. MG1655에서 protein을 overexpression 하는 것이 가능한가요? 저는 genomic DNA 뽑을 때만 MG1655를 써봐서 이게 잘 자랄지조차 모르겠습니다.. 3. 만약에 MG1655에서 단백질을 뽑을 수 있다면, antibiotics를 사용하시나요?   처음 해보는 실험이라 질문이 많아 죄송합니다. protein overexpreesion with MG1655, MG1655 protein expression, MG1655 protein vector 등등 구글에서 검색해봐도 뭐가 안나오네요... 감사합니다  
회원작성글 생물깎는대학원생  |  11.11
Q. Cell seeding
1.Cell counting했더니 3x10^6 cell/ml 이고 총600ml 있어요. 2x10^6cell/ml 0.6L로 컬쳐하려면 몇ml을 넣어야되는지 계산을 알고싶습니다. 총셀양을 3×600 =1800개라고 표현하던데 X10^6은 생각안하는건지... 2. 1x10^6cell/well well당2ml 되도록 Media로 희석후 6well에 seeding하기. 4면 cell 수 256개 2.56x10^6cell/ml 이걸 6개well에 2ml씩 넣으려면 어떻게 계산하죠?ㅠㅠ 설명 감사드립니다.
회원작성글 BBlue  |  10.22
Q. 농도
안녕하세요 초보 대학원생입니다. 100pmol/µl 짜리 siRNA를 2ml의 media에 1µl를 넣으면 몇 nM일지 계산하는법을 잘 모르겠습니다ㅜㅜ  계산 도와주시면 정말 감사할 것 같습니다!!
회원작성글 우엥  |  10.05
Q. lentiviral shRNA transduction실험에서 scramble에서도 knock down되는 것 처럼 보일 때ㅜㅜ
안녕하세요.. 이문제로 몇달째 골머리를 앓고있는 대학원생 입니다. 본론부터 말씀드리자면 Scramble 서열이 들어간 shRNA와 MD2G, psPAX2로 293T에 transfection하여 얻은 lentivirus로 cell에 infection을 2번에 걸쳐 진행하였습니다. 그런데 Western blot을 진행하였을 때 항상 scramble과 shRNA 모두에서 x gene의 단백질 발현량이 현저히 줄어든다는 것입니다..    No infection, Scramble, X gene shRNA 순 입니다.   그러나 vector문제로는 보기 어려운 것이  다른 cell lin서 실험을 진행하였을 때에는 정상적으로 knock down이 진행이 됩니다.. scramble vector문제가 아니라면 virus transduction 자체가 이 유전자의 단백질 발현에 영향을 미쳤고 결과적으로는 knock down도 되지 않았다고 판단해야 할까요?  혹시 이런 경험을 해보신적이 있는 분들께 조언을 요청드립니다ㅠㅠ 감사합니다
회원작성글 밤이  |  10.05
Q. 실험데이터 이해가 안됩니다 제발 도와주세요...!
안녕하세요. 제목 그대로 실험 데이터가 이해가 안됩니다ㅠㅠㅠㅠ 지금 target siRNA로 cell에 KD을 시켜서 Real Time PCR결과를 보면 mRNA expression이 증가하는 반면 같은 cell을 KD시켜서   western blot 을 하면 protein level이 감소한걸 확인 할수 있습니다. 혹시 왜 이렇게 되는지 아시는 분 있으면 제발 도와주세요ㅜㅜㅜ 
회원작성글 살려주세요  |  09.26
Q. GFP transfection 문의
안녕하세요 불쌍한 1학기 대학원생 입니다 transfection 실험을 위해 2가지 plasmid를 준비했습니다. control: (CMV)-(GFP) target: (EF1A)-(protein A)-(CMV)-(GFP) 대략 구성은 위와 같은데 control plasmid는 target plasmid를 제한효소로 잘라서 EF1A와 protein A의 시퀀스 일부분을 제거하고 self ligation하여 직접 만든 것입니다. 그런데 transfection을 하면 target plasmid와 control plasmid가 계속 동일한 효과를 보입니다. 면역 세포에 transfection을 하면 negative group 대비해서 target group에서 유의미한 변화가 있습니다만 GFP group마저 cytokine 발현이나 분화가 비슷하네요;; 혹시 plasmid cloning이 잘못된건가 싶어 sequencing까지 해보았는데 제한효소로 잘 잘려있더라구요 이렇다면 cloning보다는 이 실험 설계 자체의 문제로 봐야 할까요? 감사합니다.
회원작성글 dr.med.vet..  |  09.16
Q. 박테리오파지와 대장균을 이용한 실험 문의 (고등학생 실험 ㅠㅠ)
아직 고등학교를 다니는 학생인데 하고자 하는 실험에 대해 알고 있는 지식이 많이 부족해서 질문드립니다! 먼저 하고자 하는 실험은 박테리오파지를 이용한 코로나바이러스 대체 실험인데요.  박테리오파지와 코로나 바이러스가 단백질로 구성된 캡시드를 가지고 있다는 유사성을 이용해서 박테리오파지 -> 코로나바이러스 역할, 대장균 -> 인간(숙주) 역할 로 사용할 예정입니다. 박테리오 파지에 단백질을 변형시킬 수 있는 후보 물질 (강산, 강염기, 열 가해주기 등등) 을 넣어준 후 대장균에 박테리오파지를 넣어 대장균이 살아남는지 알아보는 실험입니다. 만약 대장균이 살아남아 군집을 형성한다면 박테리오파지 억제 물질이 효과가 있다는 거고, 살아남지 못하면 효과가 없다는 것을 의미하는 그런 실험인데요. 제가 궁금한건  1) 박테리오파지에 강산, 강염기 등의 물질을 어떻게 첨가해야할 지 ...? 별 생각없이 그냥 마이크로 피펫으로 넣으려했는데 이건 좀 아닌 것 같기도 해서요 ㅜㅜ 아 물론, 강산과 강염기를 넣을 때 박테리오파지와 대장균이 살 수 있는 pH 와 pOH를 조사해 박테리오파지는 죽지 않지만 대장균은 죽을 수 있는 정도로 농도를 설정하려고 했습니다.  2) 미리 배양해둔 대장균에 박테리오 파지를 넣었을 때 대장균이 살아남았는지를 어떻게 확인해야할 지 막막합니다. 기존에 생각한 방법은 액체배지에 대장균을 배양시킨 후 거기에 물질을 첨가한 박테리오파지(실험군) 넣어 고체 배지에 배양시키는 방법인데요. 만약에 고체 배지에 대장균이 군집을 형성하면 살아남은 걸로 보는.... 그런 방법이었는데 이게 맞는 방법인지 잘 모르겠습니다.  - 글이 너무 긴데 누가 도와주셨으면 좋겠습니다 ㅜㅜㅜㅜㅜㅜ부탁드려요 
회원작성글 jeonjjun  |  09.01
Q. shRNA transient transfection시 세포가 죽어요
제가 shRNA plasmid kit를 구매하였고 제조사 매뉴얼에 따라 shRNA를 DH5a competent cell transformation -> miniprep하여 amplify했습니다.  문제는 이 shRNA를 transfection하면 세포가 절반이 죽습니다. 같은 유전자 k/o을 위해 상용하는 siRNA는 세포가 죽지도 않고 효율도 좋은데 비슷한 프로토콜로 shRNA만 썼다하면 세포가 죽어서 미치겠습니다. gene 특이적 문제도 아닌 것이 scrambled shRNA transfection한 군도 절반이 죽습니다. 같은 농도로 seeding 해도 사진과 같이 절반이 죽어있고 잘 자라지도 않으며transfection한지 다섯시간만에 저렇게 동그란 버블이 생기고 24시간 지나고 확인하면 반이 죽어있어요ㅠ Transfection reagent는 lipofectamine 2000을 썼습니다. siRNA와 viability 차이가 나는게 정상인가요? 문제점 알려주시면 감사하겠습니다.  (이 과정 중 제가 느낀 특이점은 다른 유전자들은 Colony 하나 따서 miniprep하면 농도가 300 ng/ul정도 나오는데 shRNA들은 1400 ng/ul정도로 높게 나온다는 것입니다 혹시 이것도 문제가 있는것인지...ㅠ Transfection시에는 프로토콜에서 안내하는 농도대로 처리하긴 했습니다.)
회원작성글 Mutant21  |  08.30
Q. transfection 후 selection 방법(항생제 없을 때)
안녕하세요! 현재 HeLa cell에 hygromycin과 ampicillin resistance를 갖는 플라스미드를 transfection 시키려 하는데 문제는 hygromycin을 갖고있지 않습니다ㅜㅜ 혹시 다른 selection 방법이 없을까요?
회원작성글 naut  |  08.23
Q. Adenovirus transduction 이후 cell을 떼서 다시 seeding이 가능한가요?
adenovirus를 2시간동안 infection 이후 TE로 cell을 떼서 다시 seeding해서 24시간정도 키운다면 cell이 문제없이 붙어 자랄 수 있을까요?
회원작성글 wnsl1201  |  07.26
Q. siRNA 제작
  siRNA 처리 시 오토파지의 inhibition 실험 design 중인 대학원생입니다 siRNA를 주문해야 하는데 감이 안잡혀서 질문드립니다 reference를 보다보니 'The sources of siRNAs were Atg5, Atg7, a control (no. 102655310, 102655373, and 1027280, respectively; Qiagen)' 문구가 있어서 qiagen site에서 검색하여 보니 나오질 않습니다.. 웬만하면 reference에서 사용한 제품을 쓰고싶은데.. 또 시그마에서 Atg5, Atg7에 대해 똑같이 검색했는데  Sequence Start에 따라 관련 제품이 엄청 많더라구요ㅠㅠ 무엇을 봐야하고 어떻게 주문해야하는지 감이 안잡힙니다 ㅠㅠ 도와주세요..      
회원작성글 ㄱㄱ팡  |  07.21
Q. 안녕하세요, hek293에 transfection 효율 관련 질문드립니다.
안녕하세요, 현재 hek293-cas9 세포주에  gfp가 달린 sgRNA expression vector를 transfection하는 실험을 진행하고 있습니다. FACS로 봤을 때 2번의 실험이 모두 25%정도 efficiency를 보이고 있어 efficiency를 높이는 방법을 찾고 있습니다...   세포주는 본 실험을 위해 ATCC사에서 새로 구매한 세포주를 passage 3-5정도로 풀어서 사용하고 있고요. transfection reagent은 lipofectamine 3000을 사용하고 있습니다. 6well에 90%정도 confluency일 때 실험을 진행하고 있고 serum-free media에 24시간 두면 세포가 많이 죽어버려서 현재 serum starvation 없이 진행하고 있습니다. lipofectamine과 DNA를 처리하기 전에 기존 cell media를 새로운 media(DMEM+10%FBS)로 교체하고, opti-mem에 담겨있는 incuation된 lipofectamine+DNA complex를 처리하고 있습니다. 이후 4h에 세포 상태를 한번 보고, 문제가 없으면 media 24h에 새 media(DMEM+10%FBS)로 교체, 이후 3~4day정도에 facs로 transfection된 세포를 얻고 있습니다. sgRNA plasmid는 나노드랍 장비로 purity check시 순도가 높은 것을 확인하였고 plasmid농도는 1ug/ul의 농도로 실험하고 있습니다.   transfection 후 형광현미경으로 확인 시 transfection 효율이 높아보이진 않았는데, 역시 FACS로 측정해보니 약 25~30%정도의 효율을 보이고 있는 것 같습니다. hek293은 transfection이 잘되는 세포로 알고 있는데, 뭔가 제 실험에 문제가 있는 것 같다는 생각이 강하게 듭니다...   혹시 제가 진행하고 있는 프로토콜에서 개선할 수 있는 방법을 조언해주실 수 있으신가요? 감사합니다.
회원작성글 alsgh9712  |  07.19
이전  1 02 03 04 05 06 07 08 09 10  다음
실험 회원 등급이란?
실험Q&A 회원등급안내
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아 광고