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 카테고리: 전체 > Cell Biology > Transfection
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Q. 실험데이터 이해가 안됩니다 제발 도와주세요...!
안녕하세요. 제목 그대로 실험 데이터가 이해가 안됩니다ㅠㅠㅠㅠ 지금 target siRNA로 cell에 KD을 시켜서 Real Time PCR결과를 보면 mRNA expression이 증가하는 반면 같은 cell을 KD시켜서   western blot 을 하면 protein level이 감소한걸 확인 할수 있습니다. 혹시 왜 이렇게 되는지 아시는 분 있으면 제발 도와주세요ㅜㅜㅜ 
회원작성글 살려주세요  |  09.26
Q. GFP transfection 문의
안녕하세요 불쌍한 1학기 대학원생 입니다 transfection 실험을 위해 2가지 plasmid를 준비했습니다. control: (CMV)-(GFP) target: (EF1A)-(protein A)-(CMV)-(GFP) 대략 구성은 위와 같은데 control plasmid는 target plasmid를 제한효소로 잘라서 EF1A와 protein A의 시퀀스 일부분을 제거하고 self ligation하여 직접 만든 것입니다. 그런데 transfection을 하면 target plasmid와 control plasmid가 계속 동일한 효과를 보입니다. 면역 세포에 transfection을 하면 negative group 대비해서 target group에서 유의미한 변화가 있습니다만 GFP group마저 cytokine 발현이나 분화가 비슷하네요;; 혹시 plasmid cloning이 잘못된건가 싶어 sequencing까지 해보았는데 제한효소로 잘 잘려있더라구요 이렇다면 cloning보다는 이 실험 설계 자체의 문제로 봐야 할까요? 감사합니다.
회원작성글 dr.med.vet..  |  09.16
Q. 박테리오파지와 대장균을 이용한 실험 문의 (고등학생 실험 ㅠㅠ)
아직 고등학교를 다니는 학생인데 하고자 하는 실험에 대해 알고 있는 지식이 많이 부족해서 질문드립니다! 먼저 하고자 하는 실험은 박테리오파지를 이용한 코로나바이러스 대체 실험인데요.  박테리오파지와 코로나 바이러스가 단백질로 구성된 캡시드를 가지고 있다는 유사성을 이용해서 박테리오파지 -> 코로나바이러스 역할, 대장균 -> 인간(숙주) 역할 로 사용할 예정입니다. 박테리오 파지에 단백질을 변형시킬 수 있는 후보 물질 (강산, 강염기, 열 가해주기 등등) 을 넣어준 후 대장균에 박테리오파지를 넣어 대장균이 살아남는지 알아보는 실험입니다. 만약 대장균이 살아남아 군집을 형성한다면 박테리오파지 억제 물질이 효과가 있다는 거고, 살아남지 못하면 효과가 없다는 것을 의미하는 그런 실험인데요. 제가 궁금한건  1) 박테리오파지에 강산, 강염기 등의 물질을 어떻게 첨가해야할 지 ...? 별 생각없이 그냥 마이크로 피펫으로 넣으려했는데 이건 좀 아닌 것 같기도 해서요 ㅜㅜ 아 물론, 강산과 강염기를 넣을 때 박테리오파지와 대장균이 살 수 있는 pH 와 pOH를 조사해 박테리오파지는 죽지 않지만 대장균은 죽을 수 있는 정도로 농도를 설정하려고 했습니다.  2) 미리 배양해둔 대장균에 박테리오 파지를 넣었을 때 대장균이 살아남았는지를 어떻게 확인해야할 지 막막합니다. 기존에 생각한 방법은 액체배지에 대장균을 배양시킨 후 거기에 물질을 첨가한 박테리오파지(실험군) 넣어 고체 배지에 배양시키는 방법인데요. 만약에 고체 배지에 대장균이 군집을 형성하면 살아남은 걸로 보는.... 그런 방법이었는데 이게 맞는 방법인지 잘 모르겠습니다.  - 글이 너무 긴데 누가 도와주셨으면 좋겠습니다 ㅜㅜㅜㅜㅜㅜ부탁드려요 
회원작성글 jeonjjun  |  09.01
Q. shRNA transient transfection시 세포가 죽어요
제가 shRNA plasmid kit를 구매하였고 제조사 매뉴얼에 따라 shRNA를 DH5a competent cell transformation -> miniprep하여 amplify했습니다.  문제는 이 shRNA를 transfection하면 세포가 절반이 죽습니다. 같은 유전자 k/o을 위해 상용하는 siRNA는 세포가 죽지도 않고 효율도 좋은데 비슷한 프로토콜로 shRNA만 썼다하면 세포가 죽어서 미치겠습니다. gene 특이적 문제도 아닌 것이 scrambled shRNA transfection한 군도 절반이 죽습니다. 같은 농도로 seeding 해도 사진과 같이 절반이 죽어있고 잘 자라지도 않으며transfection한지 다섯시간만에 저렇게 동그란 버블이 생기고 24시간 지나고 확인하면 반이 죽어있어요ㅠ Transfection reagent는 lipofectamine 2000을 썼습니다. siRNA와 viability 차이가 나는게 정상인가요? 문제점 알려주시면 감사하겠습니다.  (이 과정 중 제가 느낀 특이점은 다른 유전자들은 Colony 하나 따서 miniprep하면 농도가 300 ng/ul정도 나오는데 shRNA들은 1400 ng/ul정도로 높게 나온다는 것입니다 혹시 이것도 문제가 있는것인지...ㅠ Transfection시에는 프로토콜에서 안내하는 농도대로 처리하긴 했습니다.)
회원작성글 Mutant21  |  08.30
Q. transfection 후 selection 방법(항생제 없을 때)
안녕하세요! 현재 HeLa cell에 hygromycin과 ampicillin resistance를 갖는 플라스미드를 transfection 시키려 하는데 문제는 hygromycin을 갖고있지 않습니다ㅜㅜ 혹시 다른 selection 방법이 없을까요?
회원작성글 naut  |  08.23
Q. Adenovirus transduction 이후 cell을 떼서 다시 seeding이 가능한가요?
adenovirus를 2시간동안 infection 이후 TE로 cell을 떼서 다시 seeding해서 24시간정도 키운다면 cell이 문제없이 붙어 자랄 수 있을까요?
회원작성글 wnsl1201  |  07.26
Q. siRNA 제작
  siRNA 처리 시 오토파지의 inhibition 실험 design 중인 대학원생입니다 siRNA를 주문해야 하는데 감이 안잡혀서 질문드립니다 reference를 보다보니 'The sources of siRNAs were Atg5, Atg7, a control (no. 102655310, 102655373, and 1027280, respectively; Qiagen)' 문구가 있어서 qiagen site에서 검색하여 보니 나오질 않습니다.. 웬만하면 reference에서 사용한 제품을 쓰고싶은데.. 또 시그마에서 Atg5, Atg7에 대해 똑같이 검색했는데  Sequence Start에 따라 관련 제품이 엄청 많더라구요ㅠㅠ 무엇을 봐야하고 어떻게 주문해야하는지 감이 안잡힙니다 ㅠㅠ 도와주세요..      
회원작성글 ㄱㄱ팡  |  07.21
Q. 안녕하세요, hek293에 transfection 효율 관련 질문드립니다.
안녕하세요, 현재 hek293-cas9 세포주에  gfp가 달린 sgRNA expression vector를 transfection하는 실험을 진행하고 있습니다. FACS로 봤을 때 2번의 실험이 모두 25%정도 efficiency를 보이고 있어 efficiency를 높이는 방법을 찾고 있습니다...   세포주는 본 실험을 위해 ATCC사에서 새로 구매한 세포주를 passage 3-5정도로 풀어서 사용하고 있고요. transfection reagent은 lipofectamine 3000을 사용하고 있습니다. 6well에 90%정도 confluency일 때 실험을 진행하고 있고 serum-free media에 24시간 두면 세포가 많이 죽어버려서 현재 serum starvation 없이 진행하고 있습니다. lipofectamine과 DNA를 처리하기 전에 기존 cell media를 새로운 media(DMEM+10%FBS)로 교체하고, opti-mem에 담겨있는 incuation된 lipofectamine+DNA complex를 처리하고 있습니다. 이후 4h에 세포 상태를 한번 보고, 문제가 없으면 media 24h에 새 media(DMEM+10%FBS)로 교체, 이후 3~4day정도에 facs로 transfection된 세포를 얻고 있습니다. sgRNA plasmid는 나노드랍 장비로 purity check시 순도가 높은 것을 확인하였고 plasmid농도는 1ug/ul의 농도로 실험하고 있습니다.   transfection 후 형광현미경으로 확인 시 transfection 효율이 높아보이진 않았는데, 역시 FACS로 측정해보니 약 25~30%정도의 효율을 보이고 있는 것 같습니다. hek293은 transfection이 잘되는 세포로 알고 있는데, 뭔가 제 실험에 문제가 있는 것 같다는 생각이 강하게 듭니다...   혹시 제가 진행하고 있는 프로토콜에서 개선할 수 있는 방법을 조언해주실 수 있으신가요? 감사합니다.
회원작성글 alsgh9712  |  07.19
Q. transfection 후 cytokine (tgf-beta) 처리 방법
  안녕하세요  제가 현재 transfection 후 tgf-beta 처리하는 실험을 하고 있습니다.   실험 방법으로는, 첫째날에 cell seeding 을 하고, 둘째날에 trasnfection 을 진행하고 셋째날에 tgf-beta를 처리하고 넷째날에 cell을 모읍니다.   그런데 여기서 tgf-beta를 처리할때 o/n 정도 FBS가 없는상태로 두면 더 효율이 높아진다고 본것같아서 진행하려고 하는데,  그럼 transfection 할 때 fbs가 없는 media 만을 이용해서 transfection 을 진행하고 tgf-beta를 처리하는걸까요?    다른 방법을 생각해봤는데 아니면 FBS 있는 media로 transfection을 진행한 후 tgf-beta 처리할때 FBS 없는 media와 함께 넣어주는게 좋을지 고민입니다.  경험자분들 도와주세요.
회원작성글 실험실학생  |  07.18
Q. lenti particle 제작 관련 비율 문의
안녕하세요.   제가 transfection으로 lentiviral particle을 제작하고자 하는데, 찾아보니 transfer plasmid : packaging plasmid : envelpoe plasmid 이렇게 비율 4:2:1 , 4:2:1:1 , 5:2:1 등등으로 total DNA를 만들어서 transfection 진행하던데 이 비율은 어떻게 정하는지 알 수 있을까요?   실험실에서 처음 세팅하는 것이고, 찾아봐도 잘 나오지 않는 것 같아서 좀 어려운 것 같습니다ㅠ
회원작성글 피곤쓰요  |  07.15
Q. Cas9 , cas9 + gRNA vector 차이
cas9와 gRNA vecotr를 같이 넣어주게 되면 기존 cas9 만 넣었을때랑 차이가 어떤건지 알수있을까요?
회원작성글 인턴임다  |  07.12
Q. virus를 이용한 transcription factor 실험
안녕하세요  이제 막 대학원에들어온 초짜연구원입니다. 특정 transcription factor를 이용하여 특정세포로 분화되는것을 유도하는 실험을 구상중에있습니다.   다른 논문들을 보면 virus를 이용해서 transfection을 시켜사용하던데...   제가 이러한 transcription factor나 transfection 등에 대한 지식이 너무너무 없습니다. ㅠ   검색해봐도 정확하고 자세히 나오는것도 없고, virus를 제작해야한다는데 어떻게 제작해야하는건지도 모르겠구요 ㅠㅠ너무 막막합니다.   이런 정보를 알 수 있는 사이트나 혹은 책이 있을까요?ㅠ 공부를 하고싶은데 어디서 정보를 얻고 찾아야할지 전혀 감이 안옵니다.   부탁드립니다 ㅠ
회원작성글 대학원생n  |  07.08
Q. Transfection 위한 cell seeding시 Media에 FBS 넣으시나요?
안녕하세요.   내일 transfection하려고 cell을 seeding 했는데 FBS 없는 배지를 깔아줬습니다. 생각해보니 FBS가 없으면 트립신 억제가 안되어서 cell에 안좋다고 들었는데, 상관 없을까요?   트립신 처리 후 디쉬에 10% FBS가 있는 배지 첨가했고 그 배지의 20%를 따서 깔았습니다. (5:1) 이정도의 FBS 농도면 트립신 억제 가능할까요? 그리고 셀을 따서 옮기기 전 디쉬에 배지 첨가하고 파이펫팅 하는 짧은 시간에도 충분히 억제가 되는지 궁금합니다!
회원작성글 컬쳐룸도비  |  07.04
Q. hPDL(human periodontal Ligament Stem Cell) 에서 Lipofectamine Transfection 실패중인 불쌍한 석사생입니다....
hPDL(human periodontal Ligament Stem Cell)을 가지고 실험중인  불쌍한 석사생입니다.. 몇달째 Transfection 실험을 해왔고 웨스턴으로 FLAG-tag을 잡는 실험을 했는데 성공하지 못했습니다.  제품은 Invitrogene Lipofectamine 2000을 계속 사용해왔습니다.  Trouble shooting 을 다양하게 해봤습니다. 먼저 lipo, cDNA 비율도 계속 바꿨고, 회사의 프로토콜에 따라 진행했고 브릭을 참고해서 다양하게 시도도 해봤습니다..  우선 FLAG항체나, 웨스턴 할때 필요한 material엔 문제가 없습니다.  결론적으로는 Lipofectamine 2000이 아닌 3000제품을 쓰면 성공할지가 궁금해서 그런 경험이 있는 선생님들이나 어떻게 해야할지 아시는 선생님이 있으면 부탁드립니다.... 살려주세요.............  
회원작성글 오우  |  06.23
Q. siRNA-PEI nanoparticle encapsulation (gel retardation assasy) 문의 첨부파일
branched PEI (25KDa)과 siRNA (dsRNA, 20bp)를 이용해 nanoparticle을 만들고자 하는데요, 150mM NaCl, 10mM HEPES buffer에 siRNA와 bPEI를 각각 녹인 후, N/P ratio를 1에서 200까지 바꿔가며 nanoparticle 제작을 시도했고, NP 제작이 되었는지 확인하기 위해 2% agarose gel에 gel retardation assay를 진행했습니다. (SYBR Safe, TAE 0.5X) 문제는, 보통 다른 실험 논문을 확인해보면 N/P=5 정도에서 대부분의 siRNA가 encapsulation 되는 것을 확인할 수 있는데, 제가 진행한 assay에서는 N/P=200에서도 제대로 encapsulation 되지 않는 것 같습니다. 왼쪽 lane부터 순서대로 naked siRNA, N/P=1, 2, 5, 10, 40, 100, 200입니다. siRNA-PEI particel preparation protocol도 충실히 따라한 것 같은데, 왜 이런 문제가 생기는걸까요? 경험자분들의 많은 조언 부탁드립니다.   감사합니다.
회원작성글 aba1594  |  06.20
Q. 농도가 x ng/ul인 DNA에서 1ug DNA추출
농도가 x ng/ul인 DNA에서 1ug DNA를 따기 위해 필요한 volume(ul)을 구하는 방법(식)이 궁금합니다! 그리고 추가적으로 cell washing을 할 때 칼슘이온과 마그네슘이온이 없는 dPBS를 이용하는 이유가 뭔가요?
회원작성글 vg0236  |  06.08
Q. stable cell line 만드는 중인데 antibiotic selection 거쳐도 세포가 안 죽어요!!!!ㅠㅠㅠㅠ
lentivirus transduction한 cell에 항생제 투여해도 안 죽어요. 그리고 정상 세포에 항생제 투여했으면 죽어야 하는데 역시 안 죽습니다. 그렇다면, lentivirus transfection과 항생제 조제가 잘못 된 것 인가요? 참고로 항생제 중에서 50 mg/mL Hygromycin B (4도 보관)는 새 것이었고 그 stock으로 10 mg/mL Hygromycin B in DW를 어제 만들어서 -20도에 보관했습니다. 세포는 morphology 변화 없이 계속 자라서 세포 자체의 문제는 아니라고 생각합니다. 실험 조건과 방법을 간략하게 서술하겠습니다. 어디가 잘못 된 것일까요?ㅠㅠ   1. 실험 조건 - cell line species: Homo sapiens - antibiotics species (concentration): Blasticidin in DW (10 ug/mL), Hygromycin B in DW (200 ug/mL)   2. 실험 방법 Seeding 1 x 105 cells/well/2 mL in a 6-well plate   ↓ 37℃, 5% CO2 incubation for 21-24 hours ↓ media suction ↓ adding 10 ug/mL polybrene in 1 mL of 10% FBS in DMEM media and 1 mL of lentivirus soup ↓ 37℃, 5% CO2 incubation for 4 hours ↓ changing the 1 mL of 10% FBS in DMEM media and 1 mL of lentivirus soup into the 2 mL of DMEM complete media (DMEM with 10% FBS and 1% Zeilshield) ↓ 37℃, 5% CO2 incubation for 12 hours ↓ adding 10 ug/mL of Blasticidin or 200 ug/mL Hygromycin B in the 2 mL of DMEM complete media ↓ changing media with antibiotics for 2 weeks under 37℃, 5% CO2 incubation
회원작성글 아스널  |  05.31
Q. (사진있음)human cell에 plasmid DNA를 transfection했는데 2주가 지나도 세포가 잘 안 자라요. 첨부파일
세포실험 도움 요청합니다. ㅠㅠ 배지 색깔도 DMEM 배지 색이지만 현미경 X4로 했을 때 세포가 반짝거려서 혹시나하는 마음에 cell counting을 했습니다. SNU-5 cell에 Lenti-guide-Puromycin transfection 시킨게 cell viability 40%이고 Live cell이 1×10^4 cells/mL입니다. 빨리 자라라고 100파이가 아닌 6-well cell culture dish로 옮겼는데요. 혹시 transfection 자체를 다시 해야 할까요? SNU-5 cell은 암세포인데 이렇게 늦게 자라는게 이상합니다. 사진도 올립니다. 다른 세포주는 참고용으로 보시면 되십니다. 감사합니다.
회원작성글 아스널  |  05.26
Q. HEK293 transient expression 질문 드려요~
Lipofectamine 3000 사용하여 HEK293에 transient expression 테스트 중입니다.   1. Protocol에서 transfection 전날 적정 농도의 cell을 seeding하면 된다고 나와 있는데, transfection 시, culture media를 Opti-MEM로 교체해 줘야 하나요? 저는 기존 배지 (F-12K)를 그대로 사용했습니다.   2. Transient expression 시, antibiotics 같은 걸로 selection이 가능한가요? pHEK293 Ultra expression vector I (Takara)을 사용하는데, vector 내부에는 eukaryote에서 가능한 selectable marker가 없는 것으로 알고 있습니다.   3. Vector에 문제가 없는데도 transfection 후 발현이 안 될 수도 있나요? Control로 transfection 하지 않은 cell과 empty vector를 transfection한 것을 사용하여 비교했습니다.   고수님들 답변 부탁드려요~
회원작성글 냥냥아빠  |  05.18
Q. Cell transfection 시에 dropwise 이유
Cell transfection 시에, plasmid DNA 랑 transfection reagent 섞인 용액을  dropwise 한다고 배워서 매번 그렇게 하고 있는데~ 왜 그렇게 하는지 궁금해요.   
회원작성글 clickclick  |  05.17
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