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 카테고리: 전체 > Cell Biology > Transfection
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Q. siRNA Transfection 후 western blot 밴드 변화
siRNA 처리 후 6시간 뒤 Media Change 진행 후 48 시간 뒤에 Harvest 하여 진행하였습니다 Havest전 cell morphology상에서 transfection이 확실하게 이루어 진 것은 확인하였으나 westen blot band상에서는 control과 siRNA의 차이가 전혀 없습니다 Media change하고 시간을 48시간 보다 더 두어보는 것이 방법일까요?? 도움 좀 얻고 싶습니다
회원작성글 uuy  |  02.05
Q. retroviral vector transfection
안녕하세요    293T cell에 GFP retroviral vector transfection 을 cacl2 transfection protocol로 실험하고 있는 학생입니다.    타겟 cell에 infection 전에 transfection 후 293T cell 에서 GFP 발현이 확인 되어야 성공적으로 transfection 됐다고 체크할 수 있는 부분인지 궁금해서 질문 올립니다...   답변 주시면 감사하겠습니다.   새해 복 많이 받으세요!
회원작성글 매맴  |  01.25
Q. Transformation
안녕하세요 E. coli transformation실험을 진행하고 있습니다, Electroporation 방법으로 transformation을 진행하였는데 pulse를 주고 SOC를 바로 넣어준다음 37도 인큐베이터에서 120 rpm으로 shacking incubate를 진행하였더니 cell debris가 실처럼 가라앉아 발생하였습니다. 원인을 찾고싶은데 정보가 살짝 부족한거같아서 글 남겨봅니다.. 그리고 cell debris로 인해 transformation yeild가 치명적으로 떨어지나요??
회원작성글 brintelix  |  01.18
Q. transfection 후 cell protein 양 추정
Flag-protein plasmid를 cell에 transfection 하려고 하는데요 이후 lysis해서 total protein amount를 확인해야하는데 nanodrop으로 한다고 치고, 제가 300-500ng이 필요한데 그럼 얼마나(어떤 조건?) transfection을 해야하나요? 혹시 계산하는 방법이 있을까요? 읽어주셔서 감사합니다.
회원작성글 별헤는밥  |  01.18
Q. S.cerevisiae URA3 k/o에 대해 질문 드립니다.
현재 Cas9과 gRNA를 in vitro에서 RNP형태로 만들어 PEG-mediated transformation으로 S.cerevisiae protoplast에 넣어주는 과정을 실험하고 있는 학생입니다. Cas9/sgRNA로 URA3를 target해서 실험을 진행하였습니다. 해당 과정을 완료한 뒤 YPD-5-FOA배지에 도포한 후 뜨는 colony만 새 YPD-5-FOA 배지로 옮겼는데 잘 자랐습니다. YPD-5-FOA yeast extract 1% Bacto peptone 2% 50% glucose 2% Agar 2% auto 후 5-FOA 1mg/ml 그래서 교차 검증을 위해서 SC-U 배지에서 해당 cell들을 키워봤는데... 똑같이 또 잘 자랍니다.. SC-ura- a.a-ura 0.77g N base w/o a.a 3.35g pH 5.4~5.5 Agar 10g TDW 470ml auto 후 glucose 20ml ---------------------------- Total 500ml   원인을 찾고 싶은데,,, 고수님들께서 도움을 주시면 감사하겠습니다...
회원작성글 수박고구마  |  01.11
Q. H2B-mcherry (YFP etc) transfected gastric cancer cell line (AGS,SNU..) 보유하신 선배님 계실까요!
선배님들 안녕하세요. time-lapse (live cell imaging) 실험에 필요한  H2B-mcherry transfected gastric cancer cell lines 보유하신 선배님들 계신지 여쭙고자 질문 올렸습니다. 항상 감사합니다!!  
회원작성글 Orange123  |  01.09
Q. 원핵생물에서 잉여ATP
원핵생물에는 막성세포소기관이 없어서 미토콘드리아가 존재하지 않습니다. 그래서 TCA회로와 산화적인산화가 세포막에서 일어나는데 이때 발생하는 ATP가 38로 알고 있습니다. 진핵생물인 인간같은 경우는 잉여 에너지를 지방으로 바꾸어서 저장해놓는데 원핵생물은 잉여에너지를 어디에 저장해두나요? 아니, 애초에 잉여에너지가 생기는가요?
회원작성글 개같이과학사랑  |  2022.12.29
Q. Flag vector transfection 질문 드립니다!
안녕하세요 이번에 transfection을 하게 되었는데 Flag 태깅된 A라는 단백질을 사용하게 되었습니다. 그런데 Flag가 짧은 서열의 아미노산이라 Size가 작다고 알고 있고, 그럼 태깅되었을 때 A와 비슷한 size에서 발견할 수 있는 게 맞는 건가요?
회원작성글 수끼리  |  2022.12.26
Q. 293t cell lipofection시 cell 떨어짐
이제 cell 실험 시작한지 두달 정도 된 새내기 입니다 293 cell에 특정 plasmid를 넣어서 유전자 발현량을 확인하는 실험을 하는 중입니다 cell에 lipofection으로 lipofectamine 2000 opti-mem으로 transfection을 하고 지금은 24well에서 진행중입니다. plasmid와 lipo incubation 후 기존 배지(dmem) 반정도 제거 후 treat하는데 plate에서 세포가 너무 많이 쉽게 떨어지는데 잘 안떨어지게 하는 방법이 있을까요? well을 기울인 후 200ul 정도를 조심히 넣어주고 있는데 항상 solution 넣는 well 아래 부분보다는 중앙부분과 위쪽에서 더 많이 떨어집니다 ㅠㅠ 기울여서 처리하는 과정에서 cell이 공기중에 오래 노출되고 분주하는 과정에서 plate가 흔들려서 그런건지 pipet으로 조심히 넣는다고 하는데 pipet 다루는게 미숙해서 그런지 절반 정도 까지 떨어지는 것 같네요 조언받을 만한게 있는지 여쭤봅니다
회원작성글 cheong  |  2022.12.20
Q. siRNA를 이용한 transfection 문제 해결 방법 방안에 대하여 부탁드리겠습니다.
현재 aml12cell으로 siRNA를 이용하여 transfection 후 knowdown 확인을 진행 중입니다. 하지만 rtPCR을 이용하여 유전자를 분석한 결과 40% 가량 효율이 나오는 것으로 보아 knockdown이 제대로 이루어 지지 않은 것을 확인 할 수 있었습니다.. protocol은 1. anti가 없는 media에 Lipofectamine mixture를 주입하고 6h 후 배지를 첨가하여 24h 동안 배양합니다. (media는 opti-MEM이 아닌 normal media를 이용하였습니다.) (Lipofectamine 2000을 이용하여 6well 기준 4uL/well 로 실험을 진행하였습니다.) 2. 그 후 FBS와 anti가 media로 change 한 후 24h 동안 추가로 배양합니다. 3. 마지막으로 sample을 처리하여 24h 동안 배양 후 rtPCR 및 western을 진행하고 있습니다. 여기서 문제점은 Lipofectamine을 주입하고도 cell이 damage를 받지 않는 다는 점에서 transfection에 문제가 있지 않나 싶습니다. 선배님들의 조언을 부탁드리겠습니다. 감사합니다.
회원작성글 졸업을위하여  |  2022.12.08
Q. THP-1 transfection 고수 있으신가요? 도와주세요...
안녕하세요. THP-1 cell에 protein overxpression을 시켜서 실험을 하려고 하고 있습니다. THP-1cell이 기존에 효율이 좋지 않다고 알려져 있어서 NATE (invivogen사)와 Gene X plus (ATCC사) reagent를 사용하여 transfection을 진행해서 결과를 확인했습니다. (trasnfection을 잘 되었습니다. time-dependent하게 감소하긴했지만요.) 그런데 PMA를 처리시 cell이 부착되지 않고 거의다 죽어서 떠있는 것을 확인했습니다. 실험해보신분들은 transfection 세포수 대비 DNA양을 얼마나 하시는지와 transfection하고 PMA처리 타이밍 및 농도 알려주시면 감사하겠습니다. 제가 하는 protocol에서 문제가 될 것 같은 부분도 알려주시면 감사합니다.  제 transfection 조건은 다음과 같습니다. 1. 6well에 2X10^6/well volume 2ml seeding 2. NATE(100X) reagent 20ul 처리 (한 tube에 NATE넣고 세포 넣고 seeding 하긴합니다.) 3. opti-MEM 100ul (vector 6ug) + 100ul (Gene X plus 12ul) / DNA: Gene X pus =1:2 / Mix RT 20분 반응 4. well에 drop으로 처리 하고 있습니다.  5. 12 h 후 PMA(100nM) 처리했더니 세포가 다 죽었습니다. 저는 PMA 100nM로 36 h / LPS 10ng/ml 6 h / Nig 5uM 30min 조건으로 실험을 해서 transfection후에 최대한 빨리 PMA를 치고 싶은 마음이 있어서 이렇게 했는데 다른 분들은 어떻게 하시나요..? 혹시 PMA로 먼저 분화를 시키고 transfection을 해야 할까요?
회원작성글 규쟁  |  2022.12.07
Q. ES cell line lentiviral transduction 후 delay된 cell death
최근 embryonic stem cell 라인에 lentivirus를 이용하여 transduction을 시켜주는 실험을 하고 있습니다.  Infection으로부터 24시간 후 selection을 시작해주었고 세포는 몇 일 동안 잘 자라서 passaging도 한번 해주었습니다. 한 5-6일 정도는 selection drug이 포함된 미디엄에서 아무 문제 없이 잘 자란 것 같습니다. 그런데 갑작스럽게 massive한 cell death가 발생하기 시작했습니다. 세포가 자라기는 하는 것 같은데 그 속도와 비슷하게 (아니면 조금 더 빠르게?) 사멸하여 육안으로도 둥둥 떠있는 세포가 보일 정도입니다. 현미경 상으로 관찰하였을 때 컨탬처럼 보이는 부분은 없고, 죽은 셀만 제거해주면 바닥도 깔끔해보입니다 (mycoplasma 컨탬 검사는 안 해봤습니다). 이렇게 보면 바이러스의 문제인가 싶기도 하지만, 동일한 바이러스로 infection된 embryonic stem cell 다른 셀라인은 이상 없이 아주 잘 자라고 있어서 도대체 뭔가 싶습니다... 같은 embryonic stem cell이라도 셀라인마다 efficiency가 다를 수가 있나요? efficiency 문제라면 왜 cell death가 delay되서 나타나는지도 잘 모르겠습니다 (transduction 없이는 보통 selection 3일차에 90% 이상 사멸합니다).  작은 힌트라도 소중한 답변 주시면 정말 도움이 많이 될 것 같습니다...감사합니다!
회원작성글 BioMate  |  2022.12.01
Q. Lipofectamine 이용 transfection시에
Lipofectamine 2000 이용해서 miRNA로 셀에transfection하려고 하는데 사용해야하는 비율이 어떻게 될까요? miRNA : lipo = 1:2 정도면 충분할까요?
회원작성글 팡이  |  2022.11.21
Q. lentivirus 처리할 때, polybrene 2달 지난 것 사용했는데요. 문제가 있겠죠?
세포에 lentivirus 1 mL, 배지 1 mL을 넣고 10 mg/mL polybrene을 2 uL 넣고 인큐베이터에 넣고 퇴근했는데요. 생각해보니까 polybrene이 2달 지난거였어요. 지방 내려가야 해서 다른 사람한테 부탁하고 퇴근했는데요. 문제 발생할까요?ㅠㅠ 참고로 polybrene은 섭씨 -20도에 보관했었습니다.
회원작성글 아스널  |  2022.11.18
Q. transfection관한 질문입니다!
HEK-293T cell line에 midiprep한 plasmid DNA를 transfection하고 luc은 luminometer로 확인하고 eGFP는 형광현미경으로 확인하는데요 luc은 발현이 잘 되는데 eGFP는 형광현미경으로 거의 안 보여서 eGFP도 lysis하고 형광파장에서 찍어봤는데 발현양이 luc에 절반도 안되더라고요 똑같은 조건에서 transfection했는데 이런 경험 있으신 분들 조언주시면 감사하겠습니다 주변에 물어볼 사람도 없어서 올려봅니다ㅜㅠ
회원작성글 Luminous  |  2022.11.14
Q. MG1655에서 protein overexpression
안녕하세요, 벡터 관련해서 질문하고 싶습니다.   MG1655에서 mutant protein을 overexpression (혹은 그냥 expression)해야 하는 상황입니다. 단백질에는 His tag 가 달려 있게 sequence를 구성해야하고, 현재 pET21b vector 안에 sequence가 들어있는 plasmid로 BL21에서 발현시키고 있었습니다. IPTG를 사용하고 있어요.   1. 그런데 MG1655를 사용하게 되면 T7 promotor가 사용되는 pET vector는 사용하지 못할 것 같은데, 다른 vector가 뭐가 있을까요? 2. MG1655에서 protein을 overexpression 하는 것이 가능한가요? 저는 genomic DNA 뽑을 때만 MG1655를 써봐서 이게 잘 자랄지조차 모르겠습니다.. 3. 만약에 MG1655에서 단백질을 뽑을 수 있다면, antibiotics를 사용하시나요?   처음 해보는 실험이라 질문이 많아 죄송합니다. protein overexpreesion with MG1655, MG1655 protein expression, MG1655 protein vector 등등 구글에서 검색해봐도 뭐가 안나오네요... 감사합니다  
회원작성글 생물깎는대학원생  |  2022.11.11
Q. Cell seeding
1.Cell counting했더니 3x10^6 cell/ml 이고 총600ml 있어요. 2x10^6cell/ml 0.6L로 컬쳐하려면 몇ml을 넣어야되는지 계산을 알고싶습니다. 총셀양을 3×600 =1800개라고 표현하던데 X10^6은 생각안하는건지... 2. 1x10^6cell/well well당2ml 되도록 Media로 희석후 6well에 seeding하기. 4면 cell 수 256개 2.56x10^6cell/ml 이걸 6개well에 2ml씩 넣으려면 어떻게 계산하죠?ㅠㅠ 설명 감사드립니다.
회원작성글 BBlue  |  2022.10.22
Q. 농도
안녕하세요 초보 대학원생입니다. 100pmol/µl 짜리 siRNA를 2ml의 media에 1µl를 넣으면 몇 nM일지 계산하는법을 잘 모르겠습니다ㅜㅜ  계산 도와주시면 정말 감사할 것 같습니다!!
회원작성글 우엥  |  2022.10.05
Q. lentiviral shRNA transduction실험에서 scramble에서도 knock down되는 것 처럼 보일 때ㅜㅜ
안녕하세요.. 이문제로 몇달째 골머리를 앓고있는 대학원생 입니다. 본론부터 말씀드리자면 Scramble 서열이 들어간 shRNA와 MD2G, psPAX2로 293T에 transfection하여 얻은 lentivirus로 cell에 infection을 2번에 걸쳐 진행하였습니다. 그런데 Western blot을 진행하였을 때 항상 scramble과 shRNA 모두에서 x gene의 단백질 발현량이 현저히 줄어든다는 것입니다..    No infection, Scramble, X gene shRNA 순 입니다.   그러나 vector문제로는 보기 어려운 것이  다른 cell lin서 실험을 진행하였을 때에는 정상적으로 knock down이 진행이 됩니다.. scramble vector문제가 아니라면 virus transduction 자체가 이 유전자의 단백질 발현에 영향을 미쳤고 결과적으로는 knock down도 되지 않았다고 판단해야 할까요?  혹시 이런 경험을 해보신적이 있는 분들께 조언을 요청드립니다ㅠㅠ 감사합니다
회원작성글 밤이  |  2022.10.05
Q. 실험데이터 이해가 안됩니다 제발 도와주세요...!
안녕하세요. 제목 그대로 실험 데이터가 이해가 안됩니다ㅠㅠㅠㅠ 지금 target siRNA로 cell에 KD을 시켜서 Real Time PCR결과를 보면 mRNA expression이 증가하는 반면 같은 cell을 KD시켜서   western blot 을 하면 protein level이 감소한걸 확인 할수 있습니다. 혹시 왜 이렇게 되는지 아시는 분 있으면 제발 도와주세요ㅜㅜㅜ 
회원작성글 살려주세요  |  2022.09.26
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