안녕하세요 화학과에서 유튜브랑 구글에 의지해서 새로운 실험을 셋팅하는 대학원생입니다... 이번에 Annexin V Assay를 처음 하였는데요 샘플 준비까지 아무 문제 없다가 FACS 찍으러 가서 PBS를 200uL 넣었을 때 cell이 aggregation 되는 것 같이 보였습니다. 주변에 물어보았으나 이유를 모르거나 이 실험을 해본적이 없다고 하여 브릭에 여쭤봅니다 ㅠ Protocol The A549 cells (2.0 × 105) seeding in plate followed by overnight incubation at 37 °C. ( 6 control: non-treated cell, FITC treated cell, PI treated cell, FITC/PI treated cell X3) (PBS로 씻은 후 ) Treat Drugs with different concentrations for 24 h. Then, the cells were collected (trypsin 200 μL per well, 1 min, 600 x g centrifuge), resuspend with cold 1X PBS and 600 x g centrifuge. Cells were diluted in 1× annexin-binding buffer to about 1 × 106 cells/mL Add 5 μL of fluorochrome-conjugated Annexin V to 100 μL of the cell suspension. Incubate 15 minutes at room temperature. Protect from light. Add 1 mL 1X binding buffer and centrifuge at 600 x g for 5 minutes at room temperature. Discard supernatant. Resuspend cells in 200 µL of 1X binding buffer. Add 5 μL of Propidium Iodide Staining Solution Viability Staining Solution and incubate 15 minutes on ice or at room temperature. Apoptotic cells were analyzed by a flow cytometer (BD FACSCanto II). + 찍으러가서 FACS용 tube에 200uL 필터 후 vortex하고 PBS 200uL 넣으면 cell이 aggregation 되는 것 같이 보입니다.   * 10X binding buffer 레시피 : 0.1M HEPES, 1.4M NaCl, 25mM CaCl2 in D.W. pH를 안 맞추고 했었는데 지금 재보니 7.19 입니다 *Dye: FITC/PI   cat.88-8005-72 Invitrogen™ eBioscience™ Annexin V Apoptosis Detection Kits   어느 단계에서 문제가 있는거 같나요ㅜㅜ        

안녕하세요, 석사과정 반년차 대학원생입니다. 실험 중 세포 control 과정에서 생기는 cell loss와 관련하여 질문이 있어 글을 남기게 되었습니다..ㅜㅜ   현재 5-70% 정도의 세포사멸을 유도한 cell을 AnnexinV-Kit와 TUNEL-kit로 각각 staining하여 facs로 분석하는 실험을 진행하고 있습니다.   그런데 같은 양의 세포를 컨트롤 하더라도 Protocol step이 보다 간결한 Annexin 실험의 경우 staining후 facs로 분석하기에 충분한 양의 세포가 남는 것에 반해, TUNEL의 경우 Cell fixation (wash 과정 포함) + Cell staining (wash 과정 포함) 두 과정으로 나뉘고, Annexin에 비해 wash step도 더 많아서인지 cell loss가 많이 발생하고 있어서 고민입니다.    wash하고 centrifuge 돌리는 step이 많아서 그런 것 같은데, 이 부분을 극복하기 위해 상층액을 제거 할 때도 석션기를 안쓰고 파이펫으로 살살 떠냈거든요. 그럼에도 남는 cell이 많지 않아 고민입니다.  (처음부터 세포를 burk로 키우고 drug을 처리하여 많은 양의 세포를 핸들링하는 방법도 있겠지만, kit protocol이 명시하고 있는 세포 농도가 정해져 있고, kit assay 횟수도 이에 맞춰져 있어 이 부분은 고려하기 어려운 상황입니다.) 그렇다고 wash step을 줄이거나 대충하고 넘기기엔 staining(효소반응 등)이 제대로 이루어지지 않을 까봐 염려가 되어서요.. 현재 생각해둔 해결 방안으로는 g-force를 높여서 최대한 많은 양의 세포가 모일 수 있도록 유도하려고 하는 것인데요, 세포 종류는 Jurkat cell이고, cell maintain 할 땐 150g x 5 min으로 centri하고 있습니다. TUNEL kit 상 안내된 g-force가 300g x 5 min이어서 이전 실험에서는 이렇게 진행하였구요. 해당 세포나 관련 실험에서 cell loss를 줄이기 위해 어떠한 방법들을 고려하셨는지, 선배님들의 조언을 구하고자 합니다.   그럼 다들 하시는 실험 모두 잘 되시길 바라며, 답변 주시면 감사드리겠습니다 : )      

안녕하세요 사수없이 혼자 프로젝트를 이끌어가고 있는 신입생 입니다 ㅜㅜ 제가 cell lysis 을 하는데, lysis buffer 에 NaBh4을 20mM 넣어주는데, 넣어주면 색깔이 갈색으로 변합니다... 그리고 잔거품이 엄청 생깁니다!!!! lysis buffer 조성은 50mM Tris-HCl(pH7.6) + 8M Urea + 1% Triton X-100 + 1X protease inhibitor + 1X phosphatase inhibitor 입니다. NaBH4 은 0.5M stock(in 0.1M NaOH) 을 만들어 씁니다. Tris-HCl 은 원인이 아닌 것 같은게 그것 대신 Ammonium bicarbonate 을 써도 똑같이 갈색이 되고 잔거품이 엄청 생깁니다.. 그렇다면 Urea 때문일까요? 그런데 아무리 구글링해봐도 안나오네요 ㅜㅜ 그리고 잔거품이 생기는것도 이상합니다 ㅜㅜ NaBH4가 물이나 HCl 만나면 수소기체가 생긴다는 것은 알고있는데 그건 뽀글뽀글 큰 기포방울 같은데 지금 생기는건 엄청난 잔거품?! 입니다..  잔거품을 떠나서 일단 색깔은 왜 갈색이 되는걸까요? 혹시 아시는 분이 있나요? 제발 약간의 정보라도 부탁드립니다!

DAPI staining을 하려고 하는데 형광현미경으로 관찰할 때 염색 된게 안보이네요..ㅠㅠ몇번이나 시도했는데 실패했습니다..   *protocol 1. dmem suction 후 washing 2. fixation: 4% formaldehyde in PBS, 15min 후 washing 3. permeabilization: 0.1% Triton x-100 in PBS, 5min 후 washing 4. DAPI solution*, 5~10min 후 washing 5. 형광현미경 보기 DAPI solution* -sol1: 5ul DAPI + 995ul PBS -sol2: 10ul sol1 + 990ul PBS   제가 한건 위랑 동일시하고 혹시 문제점이 뭘까요?ㅠㅠcell은 A549사용합니다. PBS안에 4% formaldehyde와 0.1% Triton x-100 비율도 알려주세요.담번에는 실패없는 실험이 되고싶어요 도와주세요

세포를 fix permeabilization 용액으로 처리하고 소분해서 시험하는데 각 튜브에 일정하게 안들어갑니다 또 파이펫팅을 많이 할수록 유세포분석 결과가 안나오는데.... 맞는건가요?

안녕하세요!! 환경분야 연구 중인 학생입니다. 다름이 아니라 e.coli와 s.aureus 두 박테리아에 대해서 cell lysis 후에 agar plate에 배양해서 이틀 뒤에 결과를 확인해봤는데 결과가 예상치 못한 방향으로 나왔습니다. 첫번째 사진이 ecoli, 두번째가 s.a 이고 가장 위층부터 sonication, lysis buffer, original sample 순입니다. 실험을 sonication을 진행하고 dilution 했기 때문에 original 보다는 적은 농도로 나올 것으로 예상했습니다. 근데 결과는 위와 같이 lysis method를 lysis buffer로 진행했을 때만 CFU가 적게 나오고 sonication을 썼을 땐 오히려 값이 크게 나오는 걸 확인했습니다. 제가 도말이나 실험장비 cleaning을 미숙하게 해서 그런건지 아니면 제가 모르는 다른 sonication의 영향이 있는지 모르겠습니다. 결과를 어떻게 해석해야될 지 모르겠어서 여쭤봅니다.

안녀하세요, 석사 과정중인 학생입니다.   현재 T cell을 이용하여 luciferase killing assay를 진행 중인데요, 보통 luciferase를 사용할때는 sup을 이용하여 죽은 정도를 측정하거나 pellet을 이용하여 survival cell을 측정하는 것으로 알고 있습니다.   저는 후자를 이용하여 lysis를 확인하고 있는데, 과정이  target(adherent) effector 공배양 후 suction을 하여 target만 남긴 후 PBS로 washing을 한 번 하고 down합니다. 그러고 sup은 털어내 버린 다음 luciferin을 처리한 직후 측정을 하고 있습니다. 그리고 control로는 target only와 target + triton X-100을 사용하여 negative positive를 잡고 있습니다.   이때 target only에서 생존 cell이 가장 많아 값이 가장 높게 나와야 하는데 오히려 공배양 조건에서 더 높은 발광값이 나오는 경우가 반복되는데, 혹시 공배양 이후 실험과정에 문제가 있는 것인지,  이런 경우를 겪어 보신 분 계시다면 조언 부탁드려봅니다ㅠㅠ    

안녕하세요. cancer cell에서 Lipidperoxidation을 측정하고 있습니다. 실험실에서 처음으로 도전하는 실험이기도해서 실험실내에 프로토콜이 정형화 되어있지 않습니다... BODIPY 581/591 C11 (Invitrogen, D3861) 제품을 사용하고 있고 현재 Flow cytometry로 (FITC - Oxidant, PE - Reduce)를 체크하고 있습니다. 현재 염색 할떄 시약 working solution 5uM (100ul in PBS)를 이용해서 37도 인큐베이션 하고있습니다.  혹시 저와 다르게 염색을 진행하는 분이 계시는지 그리고 FACS로 detect할때 어떤 파장으로 하시는지 compensation은 어떻게 잡으시는지 궁금합니다!

dapi를 조직에 염색 할려고 하는데 절편은 다 했어요. 그 후에 고정이나, 염색법 같은게 cell에 염색하는 방법이랑 같은지 다른지 잘 모르겠네요  dapi염색 protocol좀 알려주세요 ㅠㅠ

Caco-2 cell의 Protein Quantification을 하는데 Standard Curve를 그렸을 때 BSA standard solution을 이용했을 때와 많이 차이를 보이는데 왜 이런걸까요? 이거 보완하려면 어떤 작업을 해야 할까요?

안녕하세요 ..! 지난 글에 베타액틴이 뒤죽박죽 나온다는 학생입니다.. !!!  도움을 주신 여러분들 의견을 수용해서 진행해봤는데 컨트롤 단백질양이 너무 적었는지 컨트롤만 튀었습니다.. !! 단백질 정량 방법은 1. 6well에 3T3-L1을 키워 분화군, 샘플(저농도), 샘플(중간), 샘플(고농도) 이 네가지는 1well씩 사용하여 라이시스버퍼 100uL씩 넣어 긁고 컨트롤군은 2well을 사용하여 각각 라이시스 버퍼 100uL 씩 넣어 긁고 원심분리 해주었습니다. 2. 휘날리는 콧물같은 지방을 피했긴 했는데 원심분리를 더 해도 가라앉지 않고 정말 휘날리고 있어서 큰 덩어리를 빼고 최대한 조심히 실린지로 뽑아냈지만.. 살짝씩 지방이 들어간거같긴해요. 3. 그 후 정량은 BCA assay를 실시하였고 샘플은 모두 BSA스탠다드 범위에 들어갔습니다! 하지만 컨트롤에서 흡광도가 6배 정도 낮았습니다. 4. 라이시스버퍼 양이 마이너스가 뜨지 않은 범위에서 단백질은 10ug으로 모든 샘플 동일하게 맞추었고 각각 컨트롤(protein양 12ul+ lysis양 2ul+Sample buffer 1x로 희석)은 이렇게 나왔고 나머지 4가지는 (protein 2-3ul+lysis 12+SB) 이렇게 설정되었고 이대로 제조하여 로딩하고 베타액틴을 보았습니다. 5. 그런데 다른 4가지는 베타액틴이 모두 비슷한 범위내로 나왔는데 컨트롤만 두배 높게 떴습니다..ㅠ  6. 그리고 동일한 걸로 PPAR gamma 까지 경향을 보았는데요(컨트롤제외). 4가지 군에서 오히려 분화군이 다른 샘플에 비해 좀더 낮게 발현양이 나오더라구요 ... 분명 oil-red-o 결과는 그 반대였는데... 이게 어찌된 일일까요... 7. 첨부파일은 베타액틴입니다 (왼쪽부터 컨트롤, 분화군, 샘플 3개)  

  안녕하세요, 현재 암세포에 항암제를 처리하여 발생하는 apoptosis를 flow cytometry로 확인하고 있습니다.   6 well에서 4*105개의 cell을 seeding하여 실험 중이었는데, apoptotic cell의 비율을 증가시키고 싶어 2*105개로 실험하였더니  고농도보다 저농도 항암제를 처리했을 때 live cell의 비율이 더 낮고 apoptotic cell의 비율이 더 높았습니다.   현미경으로 확인해도 저농도에서 cell이 더 많이 떠서, flow cytometry 실험보다 전 단계에서 문제가 있는 것 같은데   여러 번 treat 하여도 dose dependent하게 cell이 죽지 않아 원인을 잘 모르겠습니다... 같은 cell line으로 MTT(5*103)나 western blot(2*106)을 할 때는 dose dependent하게 죽었습니다.   혹시 이런 경우가 있으셨던 분 계실까요? 현재는 plate 내의 cell density가 apoptosis에 영향을 주지 않을까 추측중입니다.   많은 조언 부탁드립니다...댓글에 미리 감사드립니다ㅠㅠ

안녕하세요. 4T1 cell에서 chemical 처리 후 생성되는 ROS 측정을 FACS로 실험중입니다. 데이터를 분석하는 도중 Untreat group(Control-FITC)이 Unstatin 기준 100%가 나옵니다. Control그룹에서 시그널이 너무 강하게 떠서 chemical 농도별로 분석이 안되는 상황인데, control 그룹 시그널을 약하게 할 수 있는 방법이 있을까요? 처음에는 DCFH-DA working solution의 농도가 너무 높아서 그런가해서 10uM로 사용하던 것을 1uM로 줄여서 사용했습니다. 반응은 37도에서 20분 반응했습니다.

Wash, prep buffer, DEPC를 사용해주었는데 Wash buffe는 불순물 제거, Prep buffer는 RNA를 column에서 분리, DEPC는 무슨역할을 하는건가요?  각각의 역할도 맞는지 궁금합니다. 도와주세요 선배님들! 

안녕하세요 대장암으로 TRAIL과 drug 병용처리를 연구중인 학생입니다. HCT116은 대장암중에서 TRAIL에 가장 민감한 cell line중 하나로 알려져있는데 제 HCT116은 100ng/ml까지 처리를 해도 viability가 변함이 없습니다.. 새로운 stock으로 해봐도 결과는 똑같았습니다.  drug랑 병용처리 시 apoptosis가 늘어나는걸 보면 활성은 있는걸로 판단됩니다.  

안녕하세요, 현재 suspension cell line을 사용하여 drug에 의한 apoptosis 보기 위해 Annexin V/PI staining후, flow cytometry 진행 중인데요 Cell harvest 후에 counting 해서 세포 수를 맞춰준 뒤에 washing 3-4번 정도 하고 Annexin V/PI apoptosis kit 이용해서 staining 20분 하고 있습니다. 원래는 washing을 1-2번만 진행했는데 control 그룹에서도 dead cell이 너무 많아서 washing 횟수를 늘렸는데요..! 그렇게 하니까 control group에서 dead cell이 어느 정도 줄어들었습니다. 그런데 이렇게 하고 생각해보니 drug 처리한 그룹에서도 같이 dead cell이 없어졌을 것 같아서 washing을 많이 하는게 좋은 방법이 아닌가 싶어서요..! drug를 농도별로 다양하게 처리했는데 control 그룹과 큰 차이가 나지 않는 결과를 얻었는데 이게 washing을 많이 해서 dead cell이 같이 사라진 거 일수도 있나요? 아니면 그대로 해당 농도에서 셀이 죽지 않는다고 생각해도 되는걸까요..? 조언 부탁드리겠습니다!