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 카테고리: 전체 > Cell Biology > Cell lysis/Apoptosis
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Q. H2O2농도별 IC50
안녕하세요  질문이 있어서 이렇게 글을 남깁니다.   IC50값을 구하고 western 해보려고 H202 treat하고 cell harvest해야하는데   어떻게 양을 맞추엇 만들어야할지를  몰라서요 ㅠㅠ   lM stock solution (1ml) : 102ul + 898ul   0 / 0.1 / 0.5 / 1 / 10 / 30 / 100 / 300 / 1000 (uM) 입니다....   어떻게 구하면 될까요?ㅠㅠ  
회원작성글 Skskghfh  |  01.27
Q. FACs 결과가 이상하게 나왔는데 원인을 모르겟어요 첨부파일
안녕하세요 올해 막 대학원에 입학하는 대학생입니다.  암세포의 apoptosis를 확인하기 위해 FACs를 진행하게 되었는데  대학원 선배들이 바뻐 어떻게 혼자 FACs를 찍게 되었습니다. 혼자 찍는것은  처음이라 많이 서툴렀는지 결과가 이상하게 나왔습니다. 대학원 선배들에게 보여주니 이런적이 없었다고 잘 모르겟다고 하셔서 글을 써봅니다.   cell은 구강암 세포인 HSC-4 cell을 사용했습니다. 실험 방법은 1. 물질 처치(con, 중, 고농도)한 cell을 cell scraper로 땐다 2. cell들을 1차 원심을 돌린 후 cell 카운팅 3. 차가운 PBS로 2차 원심을 돌린다. 4. 상층액을 버린 후 1*10^6 /ml의 농도에 맞게 binding buffer를 넣어준다. 5. 각 농도군에서 200ul씩 따 갈색 ep튜브에 넣어 준비    [con(염색 X, pi, annexin v, con) 4개, 중농도 1개, 고농도 1개] 6. 차가운 얼음에서 15~20분간 pi, annexin v 염색을 진행 7. 1시간 안에 유세포분석기를 통해 분석 진행 이렇게 진행했습니다.  왜 층이 나눠지는지 이유를 알 수 없어 글을 써봅니다. 선배님과 교수님들의  경험을 알려주세요. 감사합니다.
회원작성글 아마존수달  |  01.16
Q. 아포토시스가 유발된 세포에 annexin V/PI 염색 후 관찰하는 실험 관련 질문입니다!
샘플을 처리하여 아포토시스가 유발된 세포에 Annexin V와 PI를 동시 염색하여 관찰하고자 합니다.   형광현미경 관련 실험 질문입니다!  샘플을 처리하고 암세포의 아포토시스를 유발한 뒤 Annexin V/PI 염색을 진행하여 아포토시스 유발 정도를 농도별로 확인하는 실험을 진행하려고 합니다! 저희가 사용할 수 있는 형광현미경이 well plate로는 관찰이 불가능하고 slide glass와 cover glass를 이용하여 진행을 해야합니다. 샘플 농도는 10 ppm, 11.5 ppm, 13 ppm 그리고 14.5 ppm을 사용하는데 10 ppm에서는 샘플을 효과가 미비하여 세포가 거의 모두 부착된 상태이고 14.5 ppm에서는 세포가 샘플의 효과로 인해 부착되지 못 하고 모두 부유합니다. 실험법을 찾아본 결과 plate에 cover glass를 놓고 seeding을 하면 훨씬 더 용이하게 형광현미경으로 결과를 관찰할 수 있다고 하는데 그렇다면 이 때 14.5 ppm의 부유하는 세포 역시 제대로 관찰이 가능할까요?! 감사합니다.
회원작성글 두드리치  |  2022.12.20
Q. Cell flow cytometry 실험 질문입니다.
현재 annexin V/PI 염색을 진행한 뒤 cell flow cytometry를 진행하려고 합니다. 논문을 찾아보면서 공부한 결과 다음과 같이 분석 시료를 만드는 것으로 확인되었습니다.   1. 6 well plate에 세포를 배양하고 샘플 처리한 뒤 harvest한 세포에 annexin V/PI 염색한 세포 준비 Control + Annexin V/PI 10 ppm  + Annexin V/PI 11.5 ppm + Annexin V/PI Control + Annexin V/PI 13 ppm  + Annexin V/PI 14.5 ppm + Annexin V/PI   2. Compensation을 목적으로 6 well plate에 세포를 배양하고 샘플 처리한 뒤 harvest한 세포에 annexin V만 염색한 세포 및 PI로만 염색한 세포 준비 Control + Annexin V 10 ppm  + Annexin V 11.5 ppm + Annexin V Control + Annexin V 13 ppm + Annexin V 14.5 ppm + Annexin V   Control + PI 10 ppm +PI 11.5 ppm + PI Control + PI 13 ppm +PI 14.5 ppm + PI   위 방법으로 일단 준비를 하는 것으로 생각했는데 2번 compensation 과정에서 각 샘플 농도마다 annexin V와 PI만 염색하는 세포를 농도별로 모두 준비해야 되는지 궁금합니다!
회원작성글 두드리치  |  2022.12.20
Q. Triton X-100 원리
Triton X-100이 세포막의 인지질을 녹일때 일어나는 작용과 반응이 궁금합니다! 상세히 설명해주시면 감사하겠습니다.ㅠ
회원작성글 shu  |  2022.12.02
Q. 감소하는 경향 확인 시 inhibitor or activator
안녕하세요. 물질에 대한 항암효능평가 실험을 하고있는 대학원생입니다. 일단 물질을 가지고 웨스턴으로 MAPK경로를 보았을 때 농도의존적으로 ERK의 확실한 감소를 보았습니다 (apop도 증가하였습니다). 따라서 ERK를 확실히 매개하는지 또 한번 확인하기위해 ERK inhibitor를 사용하여 실험을 진행해 그냥 물질만 처치할때보다 물질+erk inhibitor 처치군에서 더 많이 생존율감소 및 apop이 일어난걸 확인했습니다. 암것두 처치안한것,erk inhibitor만처치한것 비교는 차이없었습니다 이런식으로 논문을 작성해서 리뷰를 받았는데 한 리뷰어 분께서 물질만 처치했을때 erk가 감소하는경향이면 inhibitor 가 아니라 activator로 확인해야하는것 아니냐는 질문을 받았습니다. 해당 설명도 맞다고는 생각합니다. 하지만 inhibitor로 더 큰 감소를 확인했으면 이것도 erk경로를 거친다고 볼수는 없는건가요? 저는 충분히 연관있다고 생각되는데 다른분 의견도 궁금합니다 ㅜ 다른 논문을 찾아봤을떄도 pi3k경로 같은경우 apop이 일어나면 감소하는 경향이고 이걸 확인하려고 pi3k inhibitor사용하는걸 많이봐서 설정한건데 당황스러웠습니다.
회원작성글 기댕이  |  2022.11.30
Q. (Cell Apoptosis)Annexin5 staining 후 4'C에 잠시 두어도 괜찮을까요?
  안녕하세요, 저는 현재 석사 반년차 대학원생입니다.   약물 처리한 Cell을 이용해 Annexin5로 staining 진행하고 Cell Apoptosis를 관찰하는 실험을 계획하고 있습니다.   Apoptosis가 진행되는 과정을 보는 것이라 되도록 빠른 시간 안에 측정하는 것이 좋다는 것은 알고 있지만,   해당 실험 계획한 시간에 다른 일정이 생겨, Annexin5 staining까지만 진행하고 실험을 잠시 멈춘 뒤(우선 테스트 겸 진행해보는 실험이라서요), 2시간 정도 뒤에야 재개할 수 있을 것 같습니다. 이때 Staining한 Cell을 Tube에 두고 4'C 냉장고에서 보관해두어도 될까요?   아니면 staining전 Cell pellet만 얻어서 냉장고에 넣어두고(약 두시간) 일정 마친뒤에 staining을 진행하는 편이 나을까요?   2시간 사이 Cell이 다 죽어버릴 확률이 커서 측정할 가치가 없다고 판단되면 그냥 실험 스케줄을 다시 잡아볼 생각입니다..Cell 상태가 어느정도 유지될 가능성이 있다고 하면 진행해볼 계획이구요.   관련된 실험 경험이 있으시거나 해답을 아시는 선배님들이 계시다면, 답변 주시면 감사드리겠습니다..!ㅜㅜ          
회원작성글 HEHE  |  2022.11.23
Q. Hoechst, PI 실험 결과 해석 중 궁금한 것이 있습니다. 첨부파일
첨부한 사진 속 화살표가 가리키는 덩어리가 왜 생긴 것인지 궁금합니다. 교수님께서 아마도 염색 시약이 제대로 녹지 않아 덩어리진 것이라고 하셨습니다. 정확하게 레포트에 작성해야 되는데 덩어리가 왜 생긴 것인지, 해결방안은 무엇인지 알려주시면 감사하겠습니다. 실험은 DAPI대신 hoechst를 사용했고 PI는 그대로 사용했습니다.
회원작성글 펭귄뒤적  |  2022.11.17
Q. 세포 독성 실험
세포 독성 실험을 하려고 하는데요,, 논문마다 방법이 다 달라서요 혹시 셀 씨딩 후 바로 약물 투여해서 시간 관찰하시나요 아님 세포가 붙을 수 있게 하루 정도 뒤에 약믈 투여하나요...?   
회원작성글 dkaneh  |  2022.11.16
Q. cell lysis
western blot 샘플로 cell pellet을 얼렸는데 얼릴 때 pbs washing을 안해서요.. 다시 녹여서 pbs wash해도 괜찮을까요?
회원작성글 ahhhy  |  2022.11.11
Q. Annexin V/PI staining에서 compensation 질문드립니다ㅠㅜ
안녕하세요. 현재 facs를 이용해 지방세포에서 Annexin V-FITC/PI staining 으로 apoptosis 실험을 진행중인 대학원생입니다. 이전에 facs를 사용할 때는 형광 하나만 보는 실험이여서 compensation이 필요하지 않아 무난하게 진행하였는데 annexin v/pi staining을 하니 compensation이 잡히지 않아 제대로 분석을 못하고 있습니다...ㅠ 두 형광 모두 staining 한 contorl 샘플을 찍게 되면 업로드 사진과 같이 annexin v 쪽이 칼같이 잘려서 45도 정도 기울어진 상태로 찍히게 됩니다.. 찾아본 compensation 방법이나 팁에서는 compensation %를 조정하면 간섭되어 찍히던 시그널이 수직이나 수평으로 옮겨지게 되던데 저렇게 대각선으로 축이 비틀어져 버리는 케이스는 찾기가 힘들더군요.. FL2-FL1을 건드려도 올라가버린 대각선 축이 움직이지가 않습니다.. 혹시 저런 케이스의 경우 compensation을 어떻게 해야할까요? 아니면 샘플 염색의 문제일까요?..ㅠㅜ
회원작성글 주로  |  2022.11.11
Q. 96well falt bottom centri관련
안녕하세요, 현재 석사과정 중인 대학원생입니다.   cell cytotoxicity를 실시하기 위해 96well flat bottom에서 effector cell과 target cell을 co-culture한 뒤 cell pellet을 이용하여 luminescence를 측정하고자 하는데요. 이때 down하여 sup을 버릴때 그냥 털어서 버려도 문제가 없을까요? 아니면 multi pipette으로 sup을 따줘야 할까요??
회원작성글 빠릿한엉겅퀴  |  2022.10.21
Q. EDTA는 식물 세포벽도 분해할 수 있나요
EDTA가 세균 세포벽의 금속 양이온과 결합해서 세포벽을 파괴한다고 하는데, 식물 세포벽도 파괴가 될까요?  아무리 찾아도 세균 혹은 식물의 세포벽에 마그네슘이나 칼슘과 같은 양이온 있다는 말은 못 찾았는데 어디에 존재하는건가요
회원작성글 btrnrqcls  |  2022.10.19
Q. LDH assay ESR문제
안녕하세요, 현재 석사과정 중인 대학원생 입니다. cell lysis 실험을 여러가지로 진행 중에 있는데 그 중 LDH assay를 여러번 진행하였습니다. 이때 항상 effector cell의 흡광도가 effector + target의 흡광도와 거의 유사한 값으로 높게(?)나오고 있습니다. 예를 들어 co culture = 0.35, effector control = 0.34 target control = 0.25 정도 입니다. 원인으로 생각해본 것은 애초에 cell lysis가 거의 생기지 않는 다는 것과 effector cell자체가 많이 죽는 다는 것 입니다. 참고로 effector cell은 CAR T cell인데 16h co-culture후 흡광도를 측정하고 있습니다. LDH kit는 dogen것을 사용 중이구요. reference들을 봤을때 기본적으로 target cell media에서 co-culture하고 IL-2는 대부분 들어가지 않아서 전날 T cell activator를 16시간 정도 처리하고 target cell media(without IL-2)에서 co-culture를 진행하고 있습니다. 몇 번째 실험을 진행해보았는데 잘 나오지 않네요ㅠㅠ
회원작성글 빠릿한엉겅퀴  |  2022.10.17
Q. annexin v/pi staining
안녕하세요오,, annexin v/pi staining에 대해 질문이 있습니다..ㅠㅠ   제가 사용할 kit는 BD bio의 cat. 556547 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I 인데요   protocol에    Staining 1. Wash cells twice with cold PBS and then resuspend cells in 1X Binding Buffer at a concentration of 1 x 10^6 cells/ml. 2. Transfer 100 µl of the solution (1 x 10^5 cells) to a 5 ml culture tube. 3. Add 5 µl of FITC Annexin V and 5 µl PI. 4. Gently vortex the cells and incubate for 15 min at RT (25°C) in the dark. 5. Add 400 µl of 1X Binding Buffer to each tube. Analyze by flow cytometry within 1 hr.   이렇게 써져 있는데, Annexin V와 PI를 넣은 후 원심분리로 상층액을 제거하지 않는걸까요?? 마지막에 400 ul의 binding buffer를 추가해주는데 그게 원심분리를 하지 않아도 되는 이유인가요??   답변 부탁드립니다 고수님드을 ㅠㅠㅠ...
회원작성글 암린이  |  2022.10.16
Q. 대장균 액체배지 배양하고 난후
안녕하세요 고등학교 과학과제 연구 시간에 대장균을 배양하는데 실험하다 막히는 부분이 있어 질문드립니다! 대장균을 액체배지에 배양하고 대장균에게 먹이를 주는방법과 또다른 액체배지로 옮기는 방법이 궁금합니다 또한 만약 항생제를 대장균에 주입 할 경우 액체배지에서의 항생제 주입방법에 대해서도 궁금합니다!
회원작성글 하느을  |  2022.10.11
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