안녕하세요, 30분~1시간 정도 세포 (hepg2) 물질 처리를 해야하는데요… 제가 사용하려는 물질과 세포 배지 (저는 MEM을 씁니다)에 간섭 때문에 배지를 사용할 수 없는 상황입니다 ㅠㅠ 이럴경우… 1.dpbs를 30분 이상 처리해도 되나요? 2.dobs에 fbs를 첨가한다면 어떤가요? 혹시 비슷한 상황이셨던 분들의 조언을 구합니다 ㅠㅠ

emb 배지에서  염료로 쓰이는 메틸렌블루와 이오신 염료 두 가지 모두 gram(+)를 inhibitor(억제)시킨다고 알고 있는데  어떤 원리로 억제시키는 건지 아는 분 있으면 설명부탁드립니다.

답변주신 전문가님들 감사드립니다.^^ 1번. 질문 학생들이 어떤 제품에 들어있는 Triclosan이 엠피실린 내선을 유발한다고 하는 연구논문을 봤는지 FDA에서 쓰지 말하고 한 Triclosan이 함유된 손소독제나 청결제품을 좀 구해서 대장균을 키운후 엠피실린을 접종한뒤 살아남은 부분이 많은 배지를 고르더라구요.. 의미가 있는 실험인가 해서요 돌연변이는 이루어 질수 없는 기전이라 어떤 의미를 찾아야 되는지 질문입니다.   2번질문 다른실험관련입니다. Trypan blue용액으로 어떤 죽은 세포와 살아있는 세포를 Haemocytometer Cell Counting을 할때 고체배지에 있는 세균을 씻어낼때 trypsin-PBS로 씻어내듯 해서 하는 건가요? 고체배지에 큰 균을 어떻게 작은 샘플통에 넣을지부터 막막해서 여쭤봅니다.

안녕하세요 HDF cell line에서 10J/cm^2으로 uva를 조사한다고 하면, 세포배양하는 dish의 면적이 9cm^2이라고 할때, 90joules를 조사하는건가요?? 답변부탁드립니다ㅜㅜ!

항생제 내성 관련 실험으로 세균돌연변이주가 있는지 검증하려고 합니다. 셀배양을 하고난 후 항생제를 넣은 다른 배지에 세포를 배양 그이후 일부 살아남은 세균이 있다면 변이가 생긴걸까요? 항생제를 계속 접종하면서다른 배지에 옮기는 과정을 몇번 정도 해야될지 질문입니다.

raw cell을 이용하여 NO 함량 측정을 진행하려고 합니다. 각 실험실마다 사용하는 well이 다르지만 final concentration은 같을까요? 그렇다면 LPS와 샘플의 volume을 1:1로 넣고 배양시켜 상등액 100ul를 취하고 측정하게되는 걸까요?? 실험실 프로토콜에도 그렇고 여러 논문을 읽어봐도 LPS와 샘플의 볼륨을 얼마나 넣는지 나오지 않아 질문드립니다. ㅠㅠ

저는 구조생물학 연구실에서 일하고 있는 대학원생입니다. Expi293F cell(mammalian cell)에서 protein을 발현하고자 하여 Cloning 단계에 있습니다. 단백질 - thromin cleavage site - 6x His tag 이런 식으로 cloning하고자 합니다. Mammalian cell에서 발현하기 위해서 codon optimization을 진행하고자 하는데 thrombin cleavage site도 codon optimize를 따로 진행해야하는지 궁금해서 질문남깁니다.

구입한 competent cell를 불려서 stock를 만들고 싶은데, 불려서 stock 제조 방법을 아래와 같이 하면 될까요?  1. LB broth배지(without Antibiotic) 5ml에 구입한 competent cell  접종 하여 O/N 배양 2. 밤새 배양한 배양액 1/100 부피로 100ml LB broth 배지를 접종하고, OD600 = 0.5 - 0.6으로 될 때 까지 배양. 3. 세포를 멸균된 50ml falcon 튜브 2개에 옮기고 얼음 위에서 20분 동안 배양. 4. 4500 rpm 및 4°C(미리 냉각 원심분리기)에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 폐기 5. 차가운 100mM CaCl2 20ml에 각 펠릿을 조심스럽게 현탁하고 얼음 위에서 1시간 동안 배양 6. 4500 rpm 및 4°C (미리 냉각 원심분리기)에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액 폐기. 7. 차가운 15% 글리세롤이 함유된 85mM CaCl2 2ml을 얼음에 두고 펠릿을 조심스럽게 현탁 한다. 8. 50 - 200µl를 넣고 -80°C에서 보관. ***위 프로토콜에서, 구입한 cell를 불리기 위해 LB에서 키울 땐, 항생제를 첨가 하지 않고 키우나요? 만약,  첨가하여야 한다면, 어떤 항생제든 상관이 없나요? ***100mM CaCl2는 DW에 녹이나요? (글리세롤 첨가 안해도 되나요?)

안녕하세요? 궁금한게 생겨서 질문 드립니다. 논문 읽다보면 어떤 논문은 WB, PCR 둘다 실험하는 사람도 있고 둘중 하나만 실험해서 보여주는 논문이 있는데 제가 알기로는 WB는 translation level 즉 단백질 발현 정도를 보고 PCR은 transcription level 즉 전사체 발현 정도를 보는거고 mRNA가 10이라고 해서 단백질이 10으로 translate 된다는것이 아니여서 보통 WB, RT-PCR 둘다 실험한다고 알고 있습니다.  WB만 실험하는 경우는 세포내에 단백질 수준에서 뭔가 변화를 일으킬때 (세포 내에서 어떤 단백질의 증가 또는 감소가 특정 신호를 활성화 또는 저해 시킬때) 어떤 단백질의 유무 혹은 증감이 영향이 있으니까 본다고 해도 PCR만 하는 경우는 mRNA의 증가가 특정 효과를 내는 단백질의 증가로 이어진다는 보장이 100 프로 없기때문에 모호한 결과를 내는 것같아서요 혹시 PCR만 해서 Figure를 만들때 특정한 이유가 있을까요??

안녕하세요! FACS 실험 중인 석사 학생입니다. 서로 다른 두 위치에 존재하는 Adipose tissue를 dissociation하고 FACS로 두 조직 간 cell population을 비교, 확인하는 실험을 하고 있습니다. 심플하고 간단한 스터디인데,, 여러 어려움들이 있습니다..!! 많이 도와주세요ㅠㅠ 1. FACS를 하기 위한 cell 수 자체가 부족합니다. 최소 10만개는 되어야 한다고 알고 있는데, 맞을까요? 2. 여러 가지 마커를 보고 싶은데, double staining 혹은 triple staining (그 이상도 가능한가요,,?) 하려면 필요한 최소 cell 수는 어떻게 될까요? 3. Dissociation 후 freezing 해 두었다가 thawing 하여 FACS 하는데, Freezing 할 때 counting 한 셀 수와 thawing 할 때 counting 한 셀 수의 차이가 큽니다..어느 정도 줄어드는 것은 감안한다고 하더라도,,, 반절이상이 사라지는데,, 어떤과정이 문제인 걸까요ㅜㅜ 4. FACS 염색 후 고정을 해 두었다가 3일 뒤에 FACS 찍었는데 cell loss가 너무 심했습니다. 염색할 때는 10만개라고 생각하고 염색했는데, event 숫자가 500, 1000 정도 밖에 되지 않습니다. 고정만으로 발생할 수 있는 상황일까요ㅜㅜ? FACS 실험하시는 분들 많은 도움 부탁드립니다ㅠㅠ

안녕하세요! A(Alexa 568, red) 단백질과 B(Alexa 488, green)의 co-localization 실험을 하기 위해서 세포를 슬라이드 글라스에 배양하고 Zeiss 컨포칼로 관찰했는데요. 위 사진에서 보시다시피 co-localization이 확인이 안됩니다. 겹치는 부분의 거의 없네요ㅜㅜ 저는 cytosol이나 membrane 쪽에서 확인될거라 가정했었거든요.  원래 A-B 인터렉션이 없다고 생각할 수 있겠지만, IP 실험을 통해 두 단백질의 결합을 충분히 확인한 상태였기 때문에, 어떻게 이걸 해석해야 할지 모르겠습니다. IP에서 interaction을 확인했지만, confocal에서 두 단백질의 co-localization이 확인되지 않는 경우도 있나요? 아니면 컨포칼 이미징에 뭔가 문제가 있었을까요? 조언 부탁드리겠습니다!

현재 lentivirus vector를 이용하여 pseudovirus를 생산하는 실험을 하고 있습니다.  Lipofectamine 3000을 이용하여 Transfection시키는 것까진 성공한것 같은데, 항상 Transduction이 안되서 고민입니다.   효율이 아주 낮긴 하지만.... positive control은 luciferase assay를 하면 나오긴 나오는데, 나머지는 샘플들은 Negative control이랑 동일 수치로 나와서 고민입니다. 혹시 Transduction 성공율(?)을 높일 수 있는 방법이 없을까요?

안녕하세요 현재 간 세포에 fatty acid를 처리해서 지방간염을 유도하여 secretion되는 cytokine을 ELISA로 측정하는 실험을 하고 있는데요. 하다가 궁금한 게 생겨서 질문드립니다. 일반적인 fatty acid 처리 protocol을 보면 fatty acid에 BSA를 conjugation 시켜 사용하라고 나와 있는데 그 이유를 아시는 분들 계시면 답변 부탁드려요 ㅠ

안녕하세요? 고수님들   다름이 아니고 이번에 실험을 하는데 세포막이 파괴되는 과정을 보고싶은데 세포막이 파괴 되는 것을 실험실에서 쓰는 현미경으로 관찰이 가능 한지요?? 논문을 찾아 보니 대부분 투과전자현미경(TEM) 혹은 주사전자현미경(SEM)으로 관찰 하든데  투과전자현미경(TEM) 혹은 주사전자현미경(SEM)으로 관찰이 가능할까요? 고수님들의 답변을 기다립니다.

안녕하세요 다음 학기부터 석사를 시작하는 학생입니다. ICC할 때 Double staining(MVB와 exosome)을 하고 싶은데 어떤 항체를 사용해야 할지, 어떤 방식으로 진행을 해야 하는지 궁금해서요 ,, 사용할 수 있는 마커를 찾아보니 굉장히 많던데 어떤 기준으로 선택을 하여 사용하는 것인지, 1차 항체를 붙일 때 두 개를 mix해서 한 번에 하는 것인지 아니면 같은 과정을 두 번 반복해야 하는 것인지 궁금합니다 ,,   실험이 처음이다 보니 모르는 것이 많습니다 ㅜ  혹시 관련 논문이나 프로토콜을 공유해 주시면 정말 감사할 것 같습니다 ...

media에 특정 세포를 injection 후 인큐베이터에 넣으면 자라남과 동시에 노폐물을 배설하는 것으로 알고 있는데요. 시간이 지나면 노폐물이 많아서 영양분 공급이 원활하지 않다고 해서 media를 갈아주었더니 기존에 injection해놓은 세포들의 상태가 좋지 않아졌습니다. 너무 자주 갈아주어 그런것일까요? ㅠㅠ 보통 교체주기를 얼마정도로 잡으시나요? 또한 교체시기가 왔을 때 보이는 media의 모습도 궁금합니다. 논문을 찾아보아도 이런 부분에 관해서는 생략된 것 같아서요..