안녕하세요. 항상 감사드립니다. 혼자 고군분투하고 있는 석사 수료생입니다.. luciferase assay를 수행해야 하는데,, 논문을 찾아가면서 필요한 material들을 정리해봤습니다.. 다음과 같이 실험하는 게 타당할지 검토해주시고 의견 주신다면 정말 큰 도움이 될 것 같습니다.   NF-κB가 특정 유전자 (gene X라고 하겠습니다) 의 프로모터에 결합해서 transcription을 조절한다는 가설로 실험을 진행하려고 합니다.   이를 위해 다음 세 종류의 플라스미드를 HEK293T cell에 transfection할 계획입니다. (1) geneX의 프로모터 (putative NF-κB binding site 포함)와 luciferase encoding region가 포함된 pGL3 basic vector → 직접 클로닝해서 얻을 예정   (2) NF-κB의 subunit 중 하나인 'p50'을 과발현시키기 위한 p50 expression vector → addgene에서 판매하는 'p50 cFlag pcDNA3' 구매 예정 → https://www.addgene.org/20018/   (3) NF-κB의 또 다른 subunit인 'RelA'를 과발현시키기 위한 RelA expression vector  → addgene에서 판매하는 'RelA cFlag pcDNA3' 구매 예정 → https://www.addgene.org/20012/   대조군을 위해 (1) 대신 putative NF-κB binding motif에 mutation을 도입한 vector도 제작할 예정입니다.   Transfection은 lipofectamine2000을 사용해서 3종류의 plasmid를 동시에 transfection할 계획입니다.   저의 디자인과 수행 방식이 타당한가요?   연구실에 자세히 물어볼 선배가 없어서 도움이 절실합니다.. Flag로 tag된 p50, RelA를 발현하는 벡터를 luciferase assay에서 해당 protein들의 과발현용으로 사용하는 것이 적절한지 확신이 서지 않습니다.. DNA binding effect에 영향을 주진 않을지.. 또 p50과 RelA는 heterodimer를 이루어서 작용하는데, flag가 둘의 결합에는 영향을 주지 않는지.. HEK293T monolayer에 세 종류의 plasmid를 동시에 transfection할 때 각각의 세포 안에 세 종류의 plasmid가 전부 들어가야 하는 건데.. 이걸 어떻게 확신할 수 있는지.. 실험에 대한 확신이 부족합니다..   고견 나누어주시면 반영해서 실험 잘 해보겠습니다. 미리 감사드립니다!!

이전에 G bead 에 1st antibody 를 붙여 pull-down assay 를 진행하여 target protein 과 GST fusion protein 이 binding 한다는 결과를 확인했습니다. 그런데 동일한 방법으로 GST pull-down 을 진행하자 GST fusion protein 은 잘 나오지만 target protein 의 binding 이 전혀 나타나지 않는 상황입니다. HEPES pH7.5 20mM, NaCl 150mM, NP-40 1% 로 두 실험 모두 동일한 buffer 를 사용하고 있는데, 도대체 어떤 문제 때문에 결과에 차이가 나타나는 걸까요?

안녕하세요   저는 현재 protein:protein interaction 실험을 진행하고 있는 학생입니다.   저는 FtsZ protein과 interaction하는 여러 protein을 확인하고자 FtsZ his-tag protein까지 cloing을 완성한 상태입니다.   현재 thermo에서 나온  PiercePull-Down PolyHis Protein:Protein Interaction Kit 를 이용하여 interaction을 확인하려고 하는데 생각보다 잘 되지않습니다. his-tag purification까지는 확실하게 되는것은 확인을 완료한 상태이긴 합니다. protocol에 따르면 1시간정도 racking하라고해서 2시간정도 늘려서 진행하기도 하였고 protein 농도도 조금 많이 넣어보기도 했습니다.(4도)   혹시 MgCl2와 같은 cofactor도 함께 넣어서 반응해야할까요? 브릭에 찾아보니 racking을 overnigt한 경우도 있더라구요 (4도)      

가능한 1차, 2차 antibody 를 바꾸지 않고 IP 를 진행하고자 하는데, 관측해야하는 protein 이 26kDa 으로 light chain 과 애매하게 겹치는 상황입니다. 현재 Flag M2 bead 를 이용하고 있으며 해당 제품의 datasheet 에는 heavy, light chain 을 줄이기 위해 sample buffer 에 DTT or 2-mercaptoethanol 을 넣지 말라고 적혀있습니다. (반드시 필요할 경우 50mM 정도 넣으라고 덧붙여있지만 말이죠.) 이를 참고하여 여러 자료를 조사해보았을 때 1. protein interaction 에 disulfide bond 가 중요한 역할을 할 경우 DTT 없이 sampling 시 protein 간 분리가 이뤄지지 않아 관측이 어려울 수 있다 2. DTT 없이 sampling 하되 boiling 을 거치면 light, heavy chain 을 줄이면서 target protein 을 분리시킬 수 있다 3. DTT 를 사용하되 boiling 을 하지 않고 RT incubation 하면 light, heavy chian 이 감소한다 는 세가지 의견이 충돌하고 있는 상황입니다. trublot 이나 antibody host 를 바꾸는 선택지를 제외했을 때, 이 경우 어떤 방식으로 IP를 진행하는게 좋을까요?  

DNA에 염기의 변이가 있다고 해서 항상 단백질 합성(translation)의 차이를 가져오지는 않는다.라고 알고 있는데요. 예) 하나의 단백질로 전사되는 3개의 염기 TCA(Serine) 중 세 번째 염기인 A가 C로 변이가 일어나도(즉, TCC) 단백질은 동일하게 세린(Serine)으로 전이되며, 반면, 첫 번째 염기 T가 A로 변이가 일어나면(즉, ACA) 단백질은 트레오닌(Threonine)으로 전이가 된다.   제가 알고 싶은것은 3개의 염기가 묶여서 하나의 단백질로 전사되어진다고 알고 있는데요.  예)GGCCTCCCTTTTGTTGAAAAAAAGTTGAG의 염기서열중 염기 3개가 어떻게 묶여지며, 이 묶여진 염기가 단백질로 전사되는 것을 어떻게 확인할 수 있는지.. 확인할 수 있는 프로그램이 있는건가요? 전공분야가 아니라 궁금해서 여쭈어 봅니다. 선배님들 알려주세요.

안녕하세요. lowry assay를 진행 후 궁금한 점이 있어 질문드립니다.   제가 찾아본 바로는 bradford assay의 경우 낮은 pH에서 단백질을 펼쳐 정확한 흡광도를 얻으려 한다 확인했습니다.   그럼 Lowry assay를 진행할 때 단백질에 SDS를 활용하여 단백질을 펼친다면 더 정확한 결과가 나오는지 궁금하여 질문 남깁니다! 추가로 SDS-page를 보면 95~100도로 가열하는데, 만약 위의 방법을 쓴다면 가열하지 않고도 SDS를 이용해 단백질을 필 수 있는지, 또 가열을 하게 된다면 단백질 정량에 문제가 없는지 알고 싶습니다.  답변 주셔서 감사합니다.

결과는 다 나왔는데 여기서 엑셀로 그래프 그리는 법을 모르겠어요 y=ax+b 이걸 어떻게 구하나요 ? 그리고 R^2은 어떻게 구하나요 ?

결과는 다 나왔는데 여기서 엑셀로 그래프 그리는 법을 모르겠어요 y=ax+b 이걸 어떻게 구하나요 ? 그리고 R^2은 어떻게 구하나요 ?

지금까지 purify 한 protein 으로 in vitro streptavidin pull-down 실험을 잘 진행하고 있었는데, streptavidin agarose 제품을 기존에 쓰던 것에서 다른 것으로 바꾼 이후부터 non-specific band 가 뜹니다. 정확히는, biotin 이 들어있지 않은 sample 에서 protein 이 streptavidin 에 binding 했다는 결과가 나오고 있습니다. 단순히 washing 문제라고 하기에는 agarose 를 바꾸기 전까지만 해도 멀쩡히 실험 결과가 잘 나오던 터라, 다른 문제가 있나 싶어 질문 올립니다. 이전에 쓰던 제품은 Novagen 69203 이고, 현재 문제가 발생한 제품은 sigma s1638 입니다. 저로서는 이 둘이 큰 차이가 없다고 판단했고, 동일 protocol 을 사용했습니다. 조언 부탁드립니다.

고등학생이구요 단백질 추출 및 정량 실험에서 무슨 단백질을 써야할지, 어떻게 구해야하는지 잘 모르겠습니다... 이왕이면 의약용으로 활용될 수 있는 단백질로 실험하고 싶은데 괜찮은 단백질 추천부탁드립니다!

 안녕하세요, GPCR을 비롯한 Signaling transduction에 관심 있는 고등학생입니다.  이를 공부함에 있어 한게를 느껴 질문을 드리게 되었습니다.  이번에 Pepducin 관련 탐구를 진행하며 직접 컴퓨팅이 가능한지 의문이 들었습니다. 지금까지 문헌연구를 하며 이론적인 부분만을 다뤄왔지만, 이번에는 좀 심층적으로 들어가서 조절기전을 직접 실현해보고 싶다는 생각이 들었습니다. 혹시 singaling 과정을 직접 컴퓨터로 관찰할 수 있는 방법이 있을까요? 꼭 이것이 아니더라도, 단백질이나 효소간의 상호작용을 직접 모델링해볼 수 있는 방법이 궁금합니다.

안녕하세요? 제가 실험을 진행하다가, 단백질의 S-S 결합을 끊는 DTT처리 후 원래대로라면 Iodoacetamide(요오드 아세트 아마이드)라는 시약을 처리 했어야 했는데 이 시약이 다 떨어져서 (제가 너무 어리석었습니다..)처리하지 못한 채 다시 이전 과정의 상태로 보관중인데요.. 요오드 아세트 아마이드는 단백질의 S-S결합이 해제된 펩타이드의 -SH기에 알킬기를 첨가하여 S-S결합의 재형성을 차단하기 위한 처리입니다. 혹시 이렇게되면 이 단백질 샘플은 버려야하는게 맞을까요..? DTT처리 후 그대로 두면 S-S기 결합이 재 형성된다고 알고있는데, 그러면 원래의 펩타이드 형태로 잘 돌아올 수 있을까요..? 단백질 샘플을 만드는데까지 시간소요가 꽤 걸려 이렇게 질문드립니다. 읽어주셔서 감사합니다. (말디토프/토프 MS분석 전처리 과정 중 발생한 일입니다..!!)

HPLC 관련 실험을 진행하고 있는 연구원 입니다. 관련 공부를 할려고 논문을 보다보니 식물 추출물 관련해서 두가지 다른 물질이 같은 retention time 을 가지고 다른 wavelength를 가집니다. 논문에서는 retention time과 wavelength를 기반으로 분류하였다고 되어 있는데 같은 부서의 연구원 분이 이 부분이 이상하다고 합니다. wavelength의 차이는 피크의 크기 차이만 생길 뿐이지 wavelength차이로는 다른 물질의 구분이 안되고 다른 물질의 구분은 retention time 만으로 한다고 합니다.  그리고 연구원 분의 말씀이 맞다면 retention time이 같은데 어떻게 다른 물질로 판단하는 기준이 뭔지 궁금합니다.  앞선 실험을 하셨던 여러 선배님들의 조언을 구합니다. 

GST를 붙이지 않은 단백질이 70kDa이고 GST를 붙였을때 96kDa라 한다면 GST-fusion protein을 SDS PAGE를 했을때 96kDa가 나오는게 맞는건가요?  GEL에는 96kDa가 아닌 70kDa가 나와서 헷갈리네요.. SDS PAGE를 하면서 GST tag가 떨어져 나올 수가 있나요? 아니면 다른 이유가 있을까요?  

안녕하세요 제가 이번에 학부 실험으로 단백질과의 결합을 실험하기 위해 GST-Pulldown assay를하고 SDS-PAGE를 했는데 결과 분석을 하는데에 있어서 헷갈리는게 있어서 질문 드립니다.  45kDa의 단백질1과 96kDa의 단백질2가 결합을 했다면, gel에 나오는 밴드는 두 단백질의 mass를 합한 141이 되어야하는건가요?  그게 아니라면 두 단백질이 결합을 했다는 사실은 어떻게 알 수 있는건가요?

안녕하세요 RIPA Lysis buffer를 만들때 저희 랩에 aliqout되어있는 MG132 50mM를 10mM로 희석해서 사용하고 있습니다. 희석할때 열이 발생하면서 흰 결정이 많이 생기는데 결정이 생긴채로  Lysis buffer를 만들어도 되는지 궁금합니다.   아니면 lysis buffer를 만들기 전날정도에 미리 희석해서 두면 결정이 좀 녹을까요..?