일반적으로 IP(Immunoprecipitation) 실험들을 찾아보니 거의다 세포로 부터 단백질을 획득한 실험이 많았습니다.제가 할려고 하는 실험은 기관 및 조직으로 부터 단백질을 획득해서 IP 실험을 통해 단백질과 수용체간의 상호작용에 대해 알아볼려고 하는데요세포실험시 사용되는 lysate buffer를 똑같이 사용해되 되는지조직실험시 사용하면 좋은 buffe가 있는지에 대해 알고 싶습니다.이곳 계시판에도 몇분이 질문을 올리신것 같은데 답변은 없어서 이렇게 질문합니다고수님들의 주옥같은 조언부탁드려요~

어떠한 단백질이 인산화가 일어날것이라는 나름의 전제를 깔고 실험 중인데...태깅된 HA로 IP 한후 pTyr, pThr 등등을 붙이는데 되는것으로 관찰이 됩니다..일단 확신을 위해선 phospho specific Ab 가  non specific 하게 붙지를 않았다는것이 증명되어야할 터인데....모든 인산화를 막는 phosphatase 같은것은 있는지 혹은 어떻게 저 phospho specific Ab 붙은것이 참으로 인산화가 일어나서 그렇게되었는지... 확인할 방법이 있으시면 부탁 드립니다.

안녕하세요제가 nuclear extract로 IP를 하려고 하는데요. nuclear extract로 IP는 처음 해봐서요.Panomics의 nuclear extraction kit을 사용해서 nucelar extract를 얻었는데요.nuclear extract로 IP 할때는 보통 얼마정도의 protein과 antibody를 사용하나요?또 beads를 wash 할 때는 어떤 buffer로 몇번정도 wash 해주나요?아시는 것만이라도 답변 주시면 감사하겠습니다.^^

Co-IP에 세포를 샘플로 이용하는 경우에는 그때그때 harvest해서 신선한 상태로 사용한다고 들었습니다. 저희가 하는 실험의 경우에는 mouse brain을 이용하고 있기 때문에 그때그때 샘플을 얻는 것이 어려운데, brain을 얼려놓고 필요한 만큼만 녹여서 사용하는 것은 어떨지 궁금합니다. 조직 샘플을 이용해 Co-IP를 하는 경우에 비슷한 어려움을 겪으신 분들 계시면 조언 부탁드리겠습니다.

peak 3,189 acylaion 안된 ghrelin 이라는 물질peak 3,212 acylation 안된 ghrelin standard (?)peak 3,301 C7 이 acylation 된 ghrelinpeak 3,315 C8 이 acylation 된 ghrelinpeak 3,339 C8 이 acylation 된 ghrelin standard (?)내일 논문 발표인데요.. 정말 모르겠네요..ghrelin 으로 IP 해서 MS 를 찍은 건데요.. standard 는 뭔가요???그리고 C7 이 acylation 되면 대략 90 정도 질량이 커져야 하는데요.... 뭐로 비교해서 90이 커져야 하나요? =.=;;;standard에 비교해야 하나요 아님.. standard 보다 작은 질량으로 찍힌 ghrelin 으로 비교해야 하나요........ 고수님들 감사합니다...

CO-IP를 실시하려고 합니다.제가 쓰는 IP kit 는 roche proteinG인데 이것의 단점은 boling 과정으로 IP를 완성합니다.그러나 native-PAGE를 위해선 boiling과정이 배제되어야하는데 그러면 Ab-Ag complex가 떨어지지 않아서 걱정입니다. 혹시 여러 master님들 방법은 없는지요.그리고,  native-PAGE에서 bromopheylblue dye는 사용할 수없는지요.

Fixed cells were visualized using an Olympus IX81 inverted epifluorescentmicroscope with an attached charge-coupled device camera (Retiga Exi, Burnaby, British Columbia, Canada) using appropriate filters with a peak excitation wavelength of 480 nm and a peak emission wavelength of 510 nm. Images were captured using IP Labs Software canalytics, Inc., Fairfax, VA).이게 무슨의미인지.....특히 NO 형광 측정에서....480 / 510 nm의 의미하는것을 설명좀 부탁드립니다

안녕하세요,HA를 tagging 하여 co-ip를 하는데 이 단백질이 IGG Heavy chain과 사이즈가 거의 같아서항체를 bead (Dyna magnetic bead) 에 cross-link (BS3을 이용해서) 했습니다. Elution할때70C에 하라고 했는데 모르고 그냥 10분간 끓였습니다. 이때 혹시 비드에 Cross-linking 한게 끊어 질수도 있나요? 미리 감사 드립니다.  

석사생활한지 얼마 안되는 초짜중에 초짜입니다 ㅠㅠA 라는 antibody를 제작 하여 antibody가 IP working을 하는지 확인하고자 A 를 293T cell에 transfection 시키고 lysate를 얻어 IP 를 진행해보았습니다 (IP : a-A(IgG 정제한), IB: a-A(IgG정제한), IP: o/n , protein A resin binding time: 2hr)o/e한 c.e 와 비교를 해보면 A 라는 protein에 tag이 달려 있어 endo 한 size 보다 5KDa 정도 위에 exo 밴드가 보이는 것을 확인하면서 IP lane에서는 exo한 밴드만 잡히는 결과를 얻었습니다혹 lysis buffer 에 문제가 있는것이 아닐까 하여 detergent 조성을 다양하게 바꾸면서 진행 해보아도 exo 한 밴드는 보이나 endo 한 밴드는 잡히질 않습니다 왜 endogeneous 한  A protein은 잡질 못하는 것일까요? 3차 구조문제? c-term 에 있는 tag의 어떤 모르는 작용? 고수님들의 따듯하고 명쾌한 답변을 기다리겠습니다 ㅠ 

A 와 B protein간의 interaction 여부를 확인하기 위해 A protein에 대한 IP 후, B protein 대한 IB를 하였습니다~그런데 B protein의 size가 55 kDa 인지라 ig band와 겹쳐져서 확인이 잘 되지 않습니다~B protein에 대한 IP 후, A protein 대한 IB를 하는 방법외에 순서를 바꾸지 않고 이를 극복할 수 있는 좋은 방법이 없을까요?? 도와주세요~~

reciprocal coimmunoprecipitation 이 뭔가요..ㅠ_ㅠprotein work를 해본적이 없어서 .. immunoprecipitation이 항체항원을 이용한 ...실험이라는 정도 밖에....설명이나 논문 알려주시면 ...

논문을 보다보면 coimmunoprecipitation을 했다면서 IP에 snail, WB에 mSin3썼다고 그림옆에 보여져 있는데...정확히 이 실험을 해본적이 없어 이해가 안 가내요..간단히라도 설명좀 해주세요...그게 무슨의미고..그렇게 하는 이유는뭔지..꼭 부탁드립니다.논문에 그런 표시가 많이 있었는데...항상 모르고 지나가거든요...부탁드립니다.

안녕하세요streptavidin agarose로 부터 bionylated protein을 elution하여그 분획을 가지고 immunoprecipitation을 진행하려고 합니다.대부분이 Harsh한 조건이라 저는 native하게 streptavidin과 biotin을 분리하고 싶은데잘 못찾겠네요...혹시 방법이나 KIT 그리고  참고할 만한 문헌이 있는지요??답변 부탁드립니다.

제가 이번에 인비XXX 사의 IP 용 protein G 레진을 사용하려고 하는데..레진에 항체를 붙이는 단계에서 0.1M Na Phosphate buffer (pH8.2) 를 사용하라고 되어있습니다..근데 조금 햇갈리는 것이..위의 버퍼가 sodium phosphate monobasic 과 dibasic 을 섞어서 pH 를 조절한건지..monobasic 만 녹이고 NaOH 로 pH 를 맞춘건지..dibasic 을 녹여서 pH 를 맞춘건지를 잘 모르겠습니다.처음엔 Na2 Phosphate 가 아닌Na Phosphate 로 되어있길래 monobasic(NaH2PO4) 를 0.1M 로 녹였는데 pH 를 측정해보니 2~3 정도의 엄청 낮은 pH 가 나와서 이걸 8.2 까지 올리는게 뭔가 잘못된것 같아서..이렇게 질문을 남깁니다.

immunoprecipitation할때 사용하는 버퍼에 tris나 nacl, np-40등이 들어가는데요~이 버퍼가 cell lysis시키는 역할도 하나요?

안녕하세요. 제가 요즘 Immunopreciopitation(IP) 실험을 하고 있는데 뭔가 석연찮은 점이 있어서 이렇게 질문을 올립니다. 저희방에서 원래 자주하던 실험도아니라서 선배님들도 조금 애매하다고 하셔서요..다름이 아니라 어떤 X 라는 화합물이 단백질 A 와 단백질 B 의 결합을 저해하는 작용을 한다고 알려져있을때 그것을 IP 로 확인을 해야 하는데 몇가지 궁금한 점이 있습니다.1. 이 경우 cell lysis buffer 는 native form 을 유지할 수 있도록 SDS 와 같은 강한 detergent 는 빼주는 것이 맞지요?2. 단백질 A 와 B 의 complex 형성이 저해되는 것을 보기 위해 위의 lysis Buffer 로 lysate 를 얻을 때 lysate 를 얻기 전에 세포를 화합물 X 로 처리해야 하는것인가요? 아니면 lysate 를 얻어서 항체를 붙인 Protein G Bead 와 incubation 해주는 단계에서 화합물을 넣어줘야 하는건가요?3. 위의 질문과 비슷한 맥락인데 세포에 아무것도 처리하지 않은 채 1 번에서의 Lysis Buffer 를 이용하여 lysate 를 얻고 sonication 까지 해줬을 경우 A 와 B 는 complex 를 이룬채 얻어지나요? 아니면 따로 떨어져서 얻어지나요? Native form 을 얻을 경우 complex 도 유지가 되는것인가요? 이미 잘 알려진 것이라 결과도 쉽게 나올줄 알았는데 제가 IP 실험에 대한 근본적인 이해가 부족한가 봅니다..ㅠㅠ 고수분들의 조언을 부탁드립니다.