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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Cell Biology > Transfection
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
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Q. 293cell에 대해서 질문이 있습니다.
293cell 로 tranfection실험을 하고 있습니다. PEI로 DNA를 tranfection하거나 LTX&PLUS로 siRNA를 tranfeciton하는데 cell이 예전보다 많이 뜹니다. Tranfeciton optimized medium (TOM) media를 사용하는데 DMEM과 media change를 할 때 많이 떠버립니다.벽면을 따라서 살살 넣어주고 있는데 예전보다 더 살살 넣는거같은데  6well에 3분의1정도가 뜨는거같습니다. cell이 계대배양을 많이 해서 안좋아져서 그런건지 예전에 만들어둔 stock을 풀고 있는데 현미경으로 봤을 때 cell의 상태가 안좋아 보이다 하루 지나면 오염이 되어 있더라구요. stock은 지금 4개정도 푼거같습니다... stock은 액체질소에서 꺼내서 37도 water bath에 뒀다가 녹으면 5분 spindown시켜 10%FBS DMEM에 풉니다. 제가 하는 tranfection과정에서 의심되는 문제점이나 stock을 풀 때의 문제점이 있을까요ㅠㅠ
회원작성글 무루  |  2020.04.09
Q. pBAD BL21
pBAD가 있으면 BL21에서도 발현 가능한가요?
회원작성글 과지주  |  2020.04.03
Q. e.coli transformation 후 protein expression
제목 그대로 e.coli에 plasmid를 transformation 후 제가 원하는 plasmid속 gene은 알아서 발현이 되나요? 아니라면 발현 시키는 방법이 따로 존재하나요? 맞다면 발현이 되기까지는 시간이 얼마나 걸리나요?
회원작성글 과지주  |  2020.03.31
Q. Western gel이 울어요!!
안녕하세요 western blot 과정 중 단백질 loading을 하는데 70V에서 삼십분 정도 한 뒤 나머지 두시간정도를 100V에서 loading시키는데요 사진에 저부분정도 내려오면 자꾸 밴드가 노란색으로 변하면서 Gel이 엄청나게 울어버려요 왜 이런건지 이유좀 알려주세요!!
회원작성글 어렵지만재밌어  |  2020.03.26
Q. bmdm culture
제가 BMDM을 Culture하고 있습니다. BMDM을 6well에 seeding해서 RNA와 Protein을 뽑는게 목적입니다. seeding은 5x10^5으로 진행하였고 seeding 2일 후 약물 처리하고 RNA와 protein을 뽑았습니다. 그런데 RNA extraction 과정 중 Isopropanol을 넣고 12,000 rpm 15min centrifuge를 하여도 전혀 pellet이 형성되지않고 protein은 scraping하고 12,000rpm 10min centrifuge 했는데 정말 작은 pellet이 형성되어 protein을 뽑기 불가능한 정도였습니다. BMDM으로 프로틴이나 RNA 뽑아보신분들 계실까요... 조언부탁드립니다.. Cell number를 늘려야하나요... 부탁드립니다 ㅠㅠㅠ 경험자분들...
회원작성글 zvdqgqq  |  2020.03.17
Q. Transfection후 western 질문입니다.
현재 Transfection후 Western으로 확인하는 실험을 하고 있습니다. 현재 제가 가진 문제는 다음과 같습니다. Detection이 되지 않아서 cell을 바꾸어서 진행했고 바꾼 cell에서도 되지않아 실험을 정상적으로 진행하고 있는 사람들에게 seeding을 해달라고 해서 실험을 진행했습니다.(총 4종류의 서로다른 사람에게 다른종류의 cell을 받았습니다) 그런데 이것을 Detection해도 모두 결과가 나타나지않습니다. 다른사람들은 동일하게 seeding한 cell로 결과가 나왔습니다. 문제는 house keeping gene인 r-tubulin마저 희미하게 나타났다는 점입니다. 실험마다 positive control을 걸어 확인하였기때문에 western 상의 문제는 아닌것으로 보입니다. 그리고 추가로 제가 transfection까지 진행하고 cell수거부터 다른사람에게 부탁해서 비교했을때도 결과가 나타나지 않았습니다. 그래서 현재 남은 문제는 transfection밖에 없다고 생각하는데 이렇게 실험결과에 큰 영향을 줄 정도로 차이날만한 행동이 있을까요..
회원작성글 범.  |  2020.03.13
Q. CRISPR-Cas9 관련 프로토콜 질문입니다ㅜㅜ
crispr-cas9 시스템을 이용해서 raw264.7의 유전자를 knockout시키려는데 처음이라서 여러 프로토콜을 찾아본 중 괜찮은 사이트를 발견했는데 혹시 이 사이트를 따라서 실험을 진행해도 될지 고민입니다... 이 사이트에는 클로닝 이후 hek293t에 재조합플라스미드를 넣고 다른 조립벡터들도 넣어서 바이러스를 불린 후 상층액을 타겟세포에 넣는 transfection과정인데.. 혹시 참고해도 될만한 신뢰가 있는 사이트인지 여쭙고 싶습니다...! 부탁드립니다ㅠ   https://www.creative-biogene.com/support/lentivirus-packaging-protocol.html
회원작성글 면역주마기  |  2020.03.11
Q. astrocyte culture에 transgene을 발현시키고 싶습니다.
안녕하세요,  astrocyte culture에 transgene을 발현시키고 싶은데요.  astrocyte에는 cmv promoter등을 이용한 transfection이 잘 안 되고 virus로 infection시켜야만 발현이 잘 된다고 들었는데 실제로 해 보신 분들께서도 동의하시나요?  reference들 찾아보니 virus infection한 논문이 많긴 하지만 transfection한 논문들이 아예 없는 건 아니어서 어느 쪽이 더 효과적인지 직접 해 보신 선생님들께 자문 구합니다. 랩에서 astrocyte culture는 아예 안 해 봐서요. ㅠㅠ transfection을 한다면 cmv promoter에 달아서 PEI나 lipofectamine으로 transfection 할 것 같고, virus를 이용한다면 aav5 사용할 예정입니다.  astrocyte 고수님들의 답변 부탁드립니다!!! 
회원작성글 부릭부  |  2020.02.26
Q. transfection후 selection하려는데 antibiotics선정에 어려움이 있습니다.
안녕하십니까 초보대학원생 입니다. 이번에 제가 pCE-hOCT3/4 gene을 Transfection했는데 selection하려고보니까 selectable marker가 안나와있더라구요.... 어떤antibiotic을 사용해야하는지 알려주실분을 찾습니다.  제가사용한 vector 주소 링크남깁니다. http://www.addgene.org/41813/
회원작성글 히끄  |  2020.02.20
Q. crispr cas9 도와주세요~
Crispr cas9 관련 K/O 실험 진행중에 있습니다. K/O하는 gene은 chromatin remodeling complex 관련 gene이구요. K/O여부를 쉽게 확인하기 위해 GFP 및 flag taaging 된 Cripr cas9 vector를 업체통해 제작한 뒤 실험에 사용했습니다. 일단 cancer cell에 사용하기 전에 vector working 부터 확인 하기 위해 293TN에 transfection 한 뒤 GFP가 발현 되는 것을 확인 하였고, protein을 걷어서 flag가 뜨는 것을 확인 하였습니다. vector에 문제가 없다는 것으로 여기고.. cancer cell에 transfection을 진행 했습니다. 293TN보다는 transfection 효율이 떨어지는 했지만.. GFP posotive한 부분을 FACS로 sorting 한 뒤 single cell을 키워 확인하려 했는데... GFP가 cell을 키울수록 사라졌네요..;;; GFP가 사라졌지만 혹시나 해서 single cell을 계속 키웠고.. 다행히 expansion이 잘되서  K/O level을  qRT-PCR 및 western을 통해 관련된 gene level이  k/o 되는 것을 확인 했습니다.. 하지만.. GFP 발현은 안되고.. flag가 western에서 잡히질 않네요? 이럴수가 있을까요? 과연 이것을 K/O 되었다고 봐야 할지 정말 아리송 하네요... 고수님들 답변 부탁드려요
회원작성글 훔냥  |  2020.02.17
Q. crispr cas9 plasmid 관련 문의
안녕하세요 현재 crispr cas9 system을 도입하려고 합니다. 특정 receptor를 knock-out시키는 목적이구요 protocol setting 중입니다. 맞는지 알려주세요! 이제 공부를 시작한 학생이라 내용에 대한 이해도가 완벽하지 않습니다. 틀린것도 있을수 있구요. 최대한 답변해 주시면 감사하겟습니다. 실험엔 crispr cas9 knock out plasmid를 사용할 것이구요 2개 vector sgRNA와 Cas9 plasmid를 co transfection 하여 cell안에 넣어서 knock out을 시킨 cell로 실험을 진행하면 되는게 맞나요...? 혹시 co transfection시 cell 양에 따른 plasmid 양을 어떻게 정하는지... cell 양은  2x10^5/well을 할꺼에요  부족한 점이 많습니다. protocol setting 하는데 참고하면 좋을 자료도 올려주시면 감사하겟습니다!
회원작성글 타햐  |  2020.01.20
Q. Transfection 관련해서 질문드립니다
안녕하세요 지금 transfection으로 애먹고잇는 대학원생입니다. 저는 이 랩에 들어와서 기존에 졸업한 선배가 만들었다는 stable cell line으로 실험을 하고 있습니다. 그 stable cell line에 다시 다른 vector로 transfection 하려고 하는 중입니다. 기존의 stable cell line은 V5 tag라고 알고있고 지금 transfection하려는 건 myc tag라서 웨스턴으로 확인해보니 myc tag가 잇는 것으로 확인됬습니다. 근데 의문인 건 overexpression을 시키려고 transfection한건데 웨스턴으로 확인해보니까 overexpression은 안되있는 것 같습니다. 서두가 너무 길었는데요 .. 결론은 transfection해서 myc tag는 있는데 overexpression이 안되는 경우도 있나요?
회원작성글 Hjin  |  2020.01.02
Q. 세포주 개발 업무란?
안녕하세요  회사 채용공고를 보다가 세포주 개발 업무라는 걸 보게되었는데요 궁금한점이 정확히 실험을 진행하는지 궁금합니다.  아시는 분 답변 주시면 감사하겠습니다. 제가 실험실에서 lipofectamine을 이용해서 동물세포에 plasmidDNA나 siRNA를 transfection하는실험을 했었는데요 이 실험이 세포주 개발과 똑같은건지 아님 다른점은 무엇인지 궁금합니다.
회원작성글 깨비스콘  |  2019.11.20
Q. 과발현 후 발현 감소(?)
  시퀀싱해서 클로닝에 문제 없는 것을 확인한 플라스미드를 세포에 넣고 단백질 발현을 살펴봤는데,   발현이 감소해요, 완전 siRNA 한것 처럼요... 이거 가능한 이야기인가요??  
회원작성글 땅콩  |  2019.11.12
Q. GFP Vector 사용이유
논문을 읽다가 궁금한점이 생겨 질문드립니다 Transfection하는데 overexpression 하고자 하는 유전자(A라 하겠습니다)를 확인하는 figure입니다. 그런데 여기서 mock/GFP/A 이렇게 3개의 비교대상을 한 그래프에 나타내고 있습니다... 갑자기 GFP가 나오는데 GFP 벡터를 뜻하는것 같은데 왜 갑자기 GFP를 사용을 하나요..? 굳이 mock도 있는데 이 GFP를 사용하는 이유가 있을까요...?
회원작성글 a4049b  |  2019.11.10
Q. KD cell line을 만들때 shRNA가 targeting하는게 CDS,UTR인지에따라 큰 차이가 있나요?
안녕하세요 실험 관련 궁금한 점이 생겨서 도움을 받고자 글을 남겨봅니다.   어떤 유전자A에 대해서 각각 CDS부분과 UTR부분을 targeting하는 shRNA가 있을때 보통 어떤 것을 더 많이 사용하나요? 아니면 KD cell line을 두 종류로 다 만드시나요? rescue실험을 할때 3'UTR KD line을 사용하는 이유도 잘 모르겠네요ㅠㅜ
회원작성글 만긔  |  2019.11.09
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