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BioLab 장재봉 교수
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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
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Q. vivaspin이나 ultrafiltration disc는 15/20kDa 단위는 없나요?
단백질 정제 후 농축을 하려고 하는데  SDS-PAGE 상에서 원하는 단백질(10kDa)외에 다른 단백질(약30kDa)가 검출되어 불순물을 제거해야될 것 같은데 찾아보니 3,5,10,30...kDa만 찾아지더라구요 15kDa나 20kDa cutoff하는 방법은 없을까요??ㅜㅜ
회원작성글 바린이  |  2021.08.18
Q. GST tag purification에 대해서 여쭈어볼것이 있어 글 올립니다.
작년에 GST tag purification을 하였고 이제 3년동안 활동을 되돌아보며 정리중인 고등학생입니다. 제가 여쭈어 볼것은 GST-GSH의 binding에 관한 것입니다. 작년에는 GSH-GST가 high한 affinity를 가지고 있어서 우리가 tag를 한 protein을 purification을 할 수 있다라고만 알고 있었습니다. 그런데 다시 되돌아보며 GST의 full term이 Glutathione S transferase인 것을 다시 생각해보게 되었습니다. GST와 GSH가 높은 친화도를 가져 결합하는 것 까지는 이해가 되는데 효소는 화학반응의 촉매 역할인것처럼 substrate를 product로 바꾸어 촉매반응을 끝내고 다시 분리가 되는데 GST 또한 효소이고 S를 전이하는 효소인 만큼 전이라는 반응을 끝내면 다시 해리되는 것 아닌가 라는 의문이 들었습니다. 만약 저렇게 해리가 되어버린다면 GST tag purification 중에 단백질의 손실이 생길 수 있지 않을 까 라는 생각이 들게 되어 이렇게 글을 쓰게 되었습니다. 정리 GST는 효소이며 효소는 화학반응을 촉매하고 다시 해리된다. GST도 그렇다면 전이반응 후 해리될 것이고 그렇다면 GST tag purification에도 해리되지 않을까라는 의문점 발생 만약 해리가 된다면 purification중에 단백질의 손실이 생기지 않을까? 만약 해리가 되지 않는 다면 어떻게 해리가 안되는가? 에 대한 질문입니다!
회원작성글 Hms  |  2021.08.14
Q. nmole을 알고 싶을때
단백질을 뽑은 media에서 단백질의 total amount 를 nmole로 알고 싶을때 계산하는 방법이 있을까요?  
회원작성글 초보석사쌤  |  2021.08.09
Q. 단백질 발현,정제 잘 안된걸까요?
  단백질 발현을 진행했는데요 왼쪽부터 마커, fraction1~8,토탈,솔루블,언바인딩,워싱입니다.   제가 궁금한 것은 fraction 1-8 가면서 점점 밴드 굵기가 얇아지는 이유와 이 단백질 발현이 잘 되었는지 입니다   일단 저 밴드가 뜬 부분이 제가 원하는 단백질 kda와 같은 위치라서   목표 단백질이 맞는 거 같긴 한데, 정제 전에 얻었던 토탈, 솔루블 밴드도 두껍게 나와서 정제가 잘 된것인지 어떻게 해석해야할지 궁금합니다..   초보라서 궁금한게많네요..  
회원작성글 zjxkck  |  2021.08.08
Q. Bradford assay 단백질 정량 문의드립니다.
Bradford assay를 통해 특정 단백질은 제외하고, 잔여 단백질의 양(농도)을 정량하고 싶은데, 특정 단백질을 제외하고 구하는 방법 혹시 있을까요?
회원작성글 아기호랭이  |  2021.08.05
Q. 단백질 버퍼, 보관온도와 안정성
안녕하세요!   단백질을 다루는 실험을 할 일이 생겨서 공부를 해보았지만 궁금한 점이 생겨 질문 남기게 되었습니다.   제가 다루는 단백질은 단백분해효소(metalloproteinase) 의 partial domain이고 E.coli에서 단백질을 발현시켜 정제해주는 회사에 요청하여 받아보았습니다.   추후 실험 과정때문에 불가피한 이유로 단백질 storage buffer 로 PBS (PH 7.0~8.0)를 요청하였는데요, 사실 PBS buffer에 효소 단백질을 안정적으로 보관할 수 있을 것 같지는 않고 glycine도 포함되어있지 않아서 얼려서 보관했을 때 안정성이 걱정됩니다.    제조사에서는 -20 ℃ 에서 보관하라고 하였는데 이것도 버퍼 때문에 -80 ℃에서 단백질에 문제가 생길수 있어서일까요?  어떤 조건에서 이 단백질을 가장 안정적으로 보관할 수 있을 지 많은 분들의 조언 부탁드립니다. 미리 감사드립니다.    도와주세요 (´;ω;`)   +) 단백질은 binding 실험에 사용될 예정입니다! 
회원작성글 딸기히어로  |  2021.08.04
Q. Histopathology 실험 관련 질문드립니다.
안녕하세요.   오래전 실험을하고 다시 회사로 들어와 실험을 진행하려고 하니 헤깔리는 부분이 있어 글을 올립니다.   HE staining을 하기위해 Processing 과정을 거치려고하는데 이전 실험실에서는 조직을 잘라 카세트에 넣은 후 최소 4시간 정도 흐르는 tap water에서 washing 과정을 거쳤습니다. 제가 알기로는 남아있는 formalin을 씻어내는 목적을 가지고 있는것으로 알고있는데 생략해도 되는 step인가요?   또한 IHC staining의 경우 이전 실험실에서는 antigen retriever를 위해 citric buffer로 100도에서 1시간동안 끓여 주었는데 이 과정도 생략해도되는 부분인지 여쭤봅니다.    
회원작성글 하나둘넷  |  2021.08.02
Q. sds page gel 해석 하는 방법 (단백질 발현 실험) 첨부파일
안녕하세요  제가 ompA라는 유전자를 pBT7이라는 벡터를 이용해 컴셀인 BL21, origami, rosetta 에다가 형질 전환을 시키고, 배양을 하고, 셀 하베스트 후 소니케이션으로 세포를 깨고 각각 토탈과 솔루블로 나눈 후 단백질 발현을 확인 하기 위해 sds page를 걸고  스테이닝, 디스테이닝 과정까지 거쳐 방금 겔 사진을 촬영한 것인데요,   맨 왼쪽이 마커이고 그 오른쪽이 T1,S1(bl 컴셀을 이용해 37도에서 배양 시켜 준 토탈과 솔루블 입니다) 그 다음은 T2 S2 (마찬가지로 bl21 컴셀을 이용했지만 이번엔 30도에서 배양 시켜 준 토탈과 솔루블입니다)   이렇게 마찬가지로 origami와 rosetta도 진행을 하여 겔 사진을 촬영하였는데   위와 같은 사진이 뜬다면 단백질 발현이 성공한 것인가요? ompA 단백질 크기가 37kda이라고 하는데 37kda부근에 밴드가 다 잡힌 것인지.. 육안 상으론 옅게 보이긴 하는데 발현된 게 맞는 것인지 궁금합니다. 그리고 한 가지 더 궁금한 것은 ,제가 실험 진행 할 때 ompA가 없는 그냥 공벡터를 따로 안 만들어줬는데 원래 실험 진행할 때 ompA가 없는 공벡터pBT7를 각각 컴셀과 형질전환 시켜서 똑같은 과정으로 실험을 진행 해야한다고 하는데 그렇게 하는 이유는 무엇인가요? 공벡터를 ompA유전자를 따로 넣어 주는 과정 없이 컴셀에 넣고 실험을 진행 했을 때    ompA 유전자가 없이도 단백질 발현이 일어나 37kda 부근에 밴드가 잡힐 수도 있어서 그런 것일까요?     
회원작성글 zjxkck  |  2021.08.01
Q. his-nickel chromatography를 이용한 protein purification이 안됩니다.ㅠㅠ
his-nickel chromatography를 이용한 protein purification이 안됩니다.ㅠㅠ soluble하게 protein이 나오는 것을 확인했는데 purification이 제대로 이뤄지지가 않네요.. protein structure에서 N-terminal or C-terminal이 안쪽에 위치할 수가 있나요?   더하여, ion exchange를 진행을 할까 하는데  his-nickel chromatography를 이용하지 않은 상태에서 ion exchange로 바로 purify를 해도 괜찮을까요?? 감사합니다!
회원작성글 어릴적올챙이  |  2021.07.30
Q. 재조합 단백질 overexpression 뒤에 supernatant에도 재조합 단백질이 있나요?
vector를 BL21(DE3)에 넣고 IPTG를 첨가 후overexpression을 하고 있습니다. 제가 궁금한건 overexpression 뒤 원심분리를 돌린 후 cell을 깨기전 제거하는 supernatant에 제가 원하는 재조합 단백질이 있는지가 궁금합니다. 원래는 cell을 깨고 purification을 하는데 그냥 간단히 activity를 보고 싶어서 supernatant를 이용해 볼까 합니다....
회원작성글 Vanguard05..  |  2021.07.15
Q. BCA assay로 protein 검출하려고 합니다.
안녕하세요 저희 연구실에서 교수님이 일단 insulin에 어떤 처리를 해서 이 놈이 계속 살아서 활성을 얼마나 오랜 시간 가지는지를 보는 실험을 하자고 하십니다.    그런데 insulin이 비싸서 싼 protein으로 사서 예비실험을 하자고 하시는데 검출법은 BCA assay 를 이용하여 PBS에 녹여서 sample을 만듭니다. 1.이 놈을 찍을 건데 혹시 insulin 말고 다른 protein 을 써도 괜찮을까요?   2. Insulin 말고 대체 protein으로 "교수님이 원하는 처리"를 했을 때 insulin과 비슷한 크기나 몰질량을 가지고 있어야할까요? 적어도 물성(수용성이라거나, S-S bond 수? 가 비슷하거나 하는 것들 말입니다.)이 비슷해야하지 않을까 하는게 제 생각입니다.    이런 종류의 실험은 해본 적 없는지라 여러분들의 고견을 여쭙니다.   
회원작성글 no_iusti  |  2021.07.07
Q. 대형원심분리 하기전 bottle 균형 맞추는 팁좀요.
 제가 transformant는 1L에 키워서 대형원심분리기 bottle에 약 500씩 넣어서 원심분리하려고 합니다. 근데 이거 무게 균형을 맞출때 미세전자저울을 사용해서 맞춰야 하나요? 전에 있던 실험실에서는 평형저울 이용해서 무게균형을 맞춰서 돌렸는데 박사과정으로 들어온 실험실에는 평형저울이 없더라구요. 그래서 보통 어떻게 bottle의 무게 균형을 맞추는지 팁좀 알려주실 수 있나요?
회원작성글 Vanguard05..  |  2021.07.05
Q. ammonium sulfate precipitation시 dialysis 시간
상등액에 있는 단백질을 얻기 위해 AS precipitation을 했습니다.  상등액 제거하고 단백질을 Tris-HCl pH6.8로 풀어준 뒤에 glycerol 50%로 첨가했습니다. 이걸 가지고 활성 측정을 하는데 사용하려는데 dialysis를 아직 못했습니다 ㅠㅠ 조금 급한 상황이라 dialysis를 생략하고 활성 측정을 해봤는데 있을지 없을진 모르긴 하지만 일단 나오지 않았습니다. dialysis안해서 AS가 남아있는게 활성에 영향을 미칠 수도 있는건가요? dialysis를 해야한다면 얼마동안 해야 AS가 빠져나갈까요?  일단 bradford결과 단백질은 100-200정도 있습니다.
회원작성글 ziw  |  2021.07.02
Q. UPRT 발현 및 반응 조건
안녕하세요. Cytosine deaminase (CD)와 uracil phosphoribosyltransferase (UPRT)의 fusion protein의 활성을 연구 중입니다. Fusion protein에서 CD gene의 발현 및 활성은 5-FC가 5-FU로 전환되는 것으로 확인되었는데 UPRT의 활성은 확인이 안됩니다. UPRT의 sequence도 한 번 더 확인하였으나 문제없었습니다. 실험한 과정은 다음과 같습니다. CD-UPRT lentiviral vector로 single clone 기원의 세포주를 만들었습니다. CD antibody로 WB 하였을 때 CD보다 큰 사이즈의 product를 확인하였습니다. 1. transduced cell line에 5-FC를 처리하여 3일 배양 후 cytotoxicity를 확인하였고 대사체 (5-FU, 5-FUMP, 5-FdUMP)를 확인하기 위해 3일 배양 sup을 사용하여 HPLC를 분석함 (결과: 5-FU만 검출됨) 2. transduced cell line을 DW에 현탁하여 freezing-thaw 3회 실시 후 200ug protein에 5-FC 100ug/mL을 처리하고 final volume을 DW 100ul로 맞추어 1hr 37도 반응시킴 (결과: HPLC 확인 시 5-FU만 검출됨) 3. Fusion protein의 구조적인 문제가 있을까 싶어 UPRT만을 발현할 수 있는 plasmid를 제작하여 transient trasfection을 HEK293에 진행하여 freezing-thawing 3회 후 200ug protein에 5-FU 100ug/mL을 처리하고 final volume을 DW 100ul로 맞추어 1hr 37도 반응시킴 (결과: HPLC 확인 시 5-FU만 검출됨) 혹시 실험과정에 문제가 있을까요? UPRT가 working하는 특별한 조건이 있는것일까요? UPRT가 반응한다면 5-FU가 5-FUMP, 5-FdUMP로 치환되어야합니다.
회원작성글 vbluehoiv  |  2021.07.02
Q. E. coli 단백질 발현 후 lysis 과정 시 문의 첨부파일
안녕하세요.   Bric의 많은 분들의 도움을 받아 클로닝을 성공적으로 진행하고 단백질 발현을 하고 있는 원생입니다.   E. coli BL21(DE3)에 pET29b vector를 삽입한 상태이고 IPTG induction 전 후 및 induction 후 시간을 비교하여 total protein에서 원하는 단백질이 잘 발현되는 것을 확인할 수 있었습니다.   그런데 lysis 후 확인해보니 전부 insoluble하게 나오더라구요. 37도씨, 20도씨 발현을 해보고 IPTG 농도도 조절해보았는데 여전합니다.   여기서 궁금한 점은.. 제가 sonication을 하지 않아도 된다고 하여 TAKARA의 xTractor buffer를 단독으로 쓰고 있습니다.   Lysis 후에 그래도 잘 solubilization 되는 것 같고 아래 결과(순서대로 마커, insoluble fraction, soluble fraction)처럼 soluble protein이 나오는 걸로 봐서는 잘 나와야 할 것 같은데.. 혹시 cell이 잘 안깨지거나 이러한 buffer의 조성이 solubility 영향을 미칠까요?   경험이 많으신 분들의 고견을 여쭙니다. 감사합니다.
회원작성글 arklion  |  2021.06.29
Q. Low copy number plasmid protein induction (with IPTG)
선생님들 안녕하세요! 이번에 1학기를 마무리하는 대학원생입니다. 특정 Low copy number plasmid를 IPTG로 induction하려고 하는데, 잘 안돼는 것 같아서 질문을 드립니다. 우선 plasmid는 앞서 말씀드린 것 처럼 low copy plasmid이고, tac promoter를 이용합니다.  induction 조건은 OD 600nm 값이 0.1-0.15일때 IPTG를 1mM (final con.) 맞춰서 넣고 1.5시간동안 배양시켰습니다. (protocol 논문이라 방법 자체는 문제가 없을 것 같습니다.) 문제는 SDS-PAGE로 과발현 된 양상이 보이지 않습니다. 다른 랩원들과 얘기해보니까 "low copy여서 잘 안보일 수 있지 않는가?"라는 의견이 나왔습니다. 그런데, 제가 알아본 내용으로는 tac promoter 일반적으로 protein expression에서 사용하는 pET28a vector의 T7 promoter보다 발현이 좋다고 알고 있고, pET28a vector의 경우 SDS-PAGE로 확인이 가능하다고 알고 있습니다.  결론적으로 SDS-PAGE에서 확인이 안됀 이유는 induction이 잘 안됬다고 생각 되는데, 제 생각이 맞는지 궁금합니다.
회원작성글 ghtlr21  |  2021.06.28
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