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 카테고리: 전체 > Molecular Biology-DNA
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Q. qRT-PCR standard curve 관련 문의
안녕하세요. qRT-PCR을 이용하여 연구를 진행하고 있습니다.   여쭤보고 싶은 것은 DNA copy수를 이용한 standard curve 작성과정에서 R^2값은 0.99이상인데 PCR efficiency가 낮게 나오는 문제입니다.   ABI Quantstudio 6 Flex모델을 이용하며, Taqman mastermix사용하였고, 10^8 ~ 10^1 copy가 되도록 plasmid serial dilution 하여 Primer/Probe를 이용한 standard curve 작성을 위한 PCR 실시하였습니다.   Amplicon size는 150-300 bp 정도입니다.   PCR cycle은 95도 15초, 50도 30초, 72도 30초로 40 cycle 실시하였습니다.   Ct mean 값을 이용한 그래프 작성 후 기울기값을 이용하여 efficiency확인한 결과 50~60%정도로 확인이 됩니다.   샘플 한두개라면 primer 자체의 efficiency문제라고 판단하겠으나 10 여개 primer와 plasmid를 이용한 분석에서 공통적으로 50~60% efficiency가 나오고 있어 의문이 들어 질문을 드립니다.   Primer inhibitor가 될 만한 물질은 포함되지 않았고, primer 자체의 효율이 낮은 것이라면 Primer와 plasmid의 조합이 이렇게 많은데 다 낮은 efficiency를 가지는 primer를 짤 확률이 낮다고 생각합니다.   전문가분들이 보시기에는 어떻게 생각하시나요? 
회원작성글 lIlllIIlll..  |  08.23
Q. gibson assembly 질문
gibson assembly 논문을 읽어도 명확히 이해가 되지 않아서 질문드립니다. 합치고 싶은 sequencing에 똑같은 sequencing을 달아서 합친다라고 이해하고 있는데 좀 더 정확히 설명해주실분 계실까요…
회원작성글 석사해말아  |  08.23
Q. 정량pcr에 대하여 질문드립니다
안녕하십니까 정량pcr을 시도하고 있는 학생입니다. 1. 추출한 gDNA에서 primer를 이용해서 target gene을 pcr 증폭시킵니다. 2. 전기영동으로밴드를 확인합니다(밴드가 안나오는 경우도 있었습니다) 3. purification을 통해서 target gene만 추출을 합니다(FastGene 회사의 PCR extraction kit를 사용했습니다.) 4. target gene의 농도를 nanodrop으로 측정하고 bp를 알고 있음으로 copy number를 구할 수 있습니다. 5. purification된 target gene을 10배씩 희석해서 rt-pcr을 진행하여 standard curve를 그립니다(x축 ct, y축 copy number) 6. sample과 10배씩 희석된 standard dna를 rt-pcr하여 sample의 copy number를 구합니다.   첫번째 질문은 이 방법이 맞는 방법인지가 궁금합니다. 두번째 질문은 플라스미드를 사용하여 standard를 잡는 이유가 궁금합니다. 플라스미드를 사용해야하는 이유? 위의 제가 고안해낸 방법은 플라스미드를 사용하지 않습니다.
회원작성글 실후  |  08.23
Q. qPCR melting curve가 이상해요...
qPCR 돌렸는데 melting curve가 각지고...이상하게 나왔어요 처음있는 일에 아무리 검색해도 안나오네요..? 대체 뭐가 문제일까요,, 아시는 연구원님들 답변 해주세요..ㅠ
회원작성글 쁘리익  |  08.23
Q. Vector restriction
1번 Lane이 Restriction enzyme(BamHI, Hindiii)를 처리한 Vector(pQE80L, 4751bp)이며 2번이 Uncut vector입니다. restriction enzyme site가 고작 146~188 사이인데 잘랐다고 이렇게 크기 차이가 생길 수 있는지가 의문이 들어서 혹시 제가 잘못잘랐다면 계속해서 cloning을 진행하면 시간낭비일것같아서 혹시 경험상 이렇게 band의 size차이가 크게 나는 경우 제한효소 처리가 제대로 되었다고 볼 수 있을까요?
회원작성글 BIOKKKS  |  08.23
Q. PCR 실험에서의 물리학
PCR 실험에서 찾을 수 있는 물리학이 있을까요?
회원작성글 밍은  |  08.22
Q. 특정 유전자를 knockout 하였을 때 단백질이 더 발현하는 경우도 있나요?
안녕하세요. 요새 T cell line을 가지고 실험중입니다. CRISPR/cas9으로 특정 유전자를 KO한 후 ELISA로 해당 유전자가 조절하는 단백질을 정량하고자 했는데 오히려 더 많이 나오더라고요. 제가 보유하고 있는 sgRNA와 cas9는 HEK293T에서 90%이상의 indel이 발생함을 확인했습니다. 물론 T cell에서 도입 효율이 떨어지겠지만 단백질양이 증가하는 것이 이해가 안됩니다. 혹시 이런 경우도 있나요?  그게 아니라면 prep 문제려나요 ㅠ 도움부탁드립니다.
회원작성글 Coreis  |  08.22
Q. 만성 골수성 백혈병 관련 질문입니다!
바보같은 질문 일 수 있는데, 전좌되는 부분이 염기서열이 있는 부분인가요? 제가 하고 싶은 건 알고리즘을 이용해서 정상 22번 bcr 유전자, 정상 9번 abl 유전자, 그리고 전좌가 일어난 필라델피아 염색체의 유전자(만성 골수성 백혈병을 일으키는) 이렇게 3개의 염기서열을 비교한 후 염기 서열이 달라진 부분을 찾아내고 싶은데, 혹시 가능한 실험일까요? NCBI에서 관련 정보를 찾던 중 아래와 같은 정보를 발견해서 헷갈립니다.. "필라델피아의 bcr(중단점 클러스터 영역) 유전자에 대한 인간 mRNA 염색체" 라는 제목인 글인데, " bcr은 9:22 염색체의 중단점 클러스터 영역입니다. 만성과 관련된 전좌(필라델피아 염색체)골수성 백혈병. 재배열되지 않은 염색체 영역은 최소 13개의 엑손이 존재하는 약 45kb. 모든 중단점 지금까지 연구된 것은 인트론 서열 내에서 발생합니다." 라고 써있어서요. 물론 제가 하고자 하는 실험은 DNA 염기서열이긴 한데, mRNA에서 인트론 서열 내에서 발생한다는 말이 걸려서 질문드립니다. 만약 전좌가 일어난 부위가 염기서열이 없는 그냥 염색체의 일부분이라면 위 실험이 불가능해 져서요...잘 아시는분 답변 부탁드립니다!
회원작성글 고닥생  |  08.22
Q. confirm PCR 질문 드립니다.
vector를 균주에 transformation 시켜놓은 상태인데요. vector가 잘들어갔는지 확인하기 위해서 colony PCR, gDNA extraction 하여 confirm PCR을 진행하려고 합니다. 또한 master plate에 screening 시켜서 확인도 해야된다고 배운거 같은데요 이론은 알겠는데 transformation 시킨뒤 다음부터 어떻게 진행을 해야되는건지 잘 알지 몰라서 질문드립니다. transformation 시킨 colony를 pick하여 seed 후 competent cell을 제작한 후 해야 되는건지.... 다음 순서를 알고 싶어 질문드립니다.
회원작성글 석사해말아  |  08.21
Q. top10, XL1 blue
plasmid를 prep하려고 competent cell을 만들고 transforamtion을 하려고 하는데 둘의 차이가 있을까요?
회원작성글 인턴임다  |  08.20
Q. 특정 관심 유전자에서 보고된 SNP를 검색할 수 있는 database
안녕하세요 초짜 대학원생입니다... 환자의 혈액샘플을 가지고 특정 유전자 (관심 유전자가 세 개 있습니다)에 대한 SNP를 확인해보려고 합니다.  그래서 이 유전자들에서 보고된 질병 연관 SNP list를 쭉 확보하려고 하는데, 사전 논문 서치보다 더 효과적인 방법이 있을까요? dbSNP (NIH)를 이용할 수 있다고 하는데, gene 하나만 검색해도 수천개가 떠서, 너무 드물지 않고 (MAF) benign하지 않은 것들을 추리고 싶습니다.  고수님들 조언 부탁드려요!  
회원작성글 뉴로민  |  08.19
Q. 전기영동 gel에 증류수 사용
전기영동 실험에서 gel의 농도를 맞출 때 TAE buffer가 아닌 증류수로 맞추면 결과를 보기 어렵나요?
회원작성글 시원한쥬스  |  08.18
Q. DNA 전기영동하는데, gel이 자꾸 위에만 밝게 나오네..
DNA 전기영동하고 있습니다. Red safe사용하고 있고요, 기계도 최신버전으로 구매한지 얼마 되지 않았습니다. 3번을 해봤는데 아래같이 계속 위에 부분만 밝게 나오고, 막상 DNA부분은 너무 어둡게 detection되네요.. 도움 부탁드리겠습니다!
회원작성글 라뛔한  |  08.18
Q. PCR 관련 조언 부탁드립니다.
안녕하세요. PCR 관련해서 조언을 얻고자 글 올립니다. 다른 DNA plasmid 몇 가지를 동일한 조건으로 PCR을 진행하였는데 다 비슷한 부분에서 band 가 생깁니다.... 원하는 부위의 band가 맞긴한데 나오면 안되는 샘플에서도 band가 나오니, 실험의 결과를 믿기가 어려워 조언 구합니다. 왜 이런 결과가 나타나는건지 아시는 분 있으시면 댓글 부탁드립니다. ㅠ.ㅠ 감사합니다.   동일한 primer F,R (농도 : 100pmol) / 5x PCR Master Mix (rTaq) / DW 를 사용했고, PCR 온도는 서치하면 나오는 기본적인 protocol 에 명시되어 있는 온도로 지정했습니다. (Tm 값은 primer 보다 5도 낮게 진행하였습니다.) * 1, 2, 3 모두 다 다른 샘플입니다.... 1, 3 은 원하는 band가 맞는데 2는 아예 band가 나오면 안된다고 생각했는데 나온거라 1, 3의 결과도 믿을 수 없는 상황입니다....ㅜㅜ    
회원작성글 실험알못  |  08.18
Q. electroporation 실험용 G+ competent cell Washing용액 질문입니다 첨부파일
electroporation을 하기위해서 G+ lactococcus lactis competent cell을 제조하고있는데요.  제가 찾은 프로토콜에서 '0.5M sucrose with 10% glycerol'로 washing하라고 나와있는데 각각 오토클레이브 돌리고 0.5M sucrose와 10% glycerol을 얼만큼 pelet에 넣어서 resuspend하는지 이해가 가지 않습니다ㅜ (파일 첨부하였습니다)   그리고 G+프로토콜 찾아보면  - 0.5M sucrose만 사용해서 CC만드는 방법 -10% glycerol만 사용해서 CC만드는 방법 - 0.5M sucrose와  10% glycerol 같이 사용해서 CC만드는 방법 이렇게 크게 세가지 인것같은데, 그냥 방법이 3가지인것인지   아니면 Staphylococcus는 0.5M sucrose로 사용, TSB로 키운 CELL은 10% glycerol만 사용 이런식으로 균주별, medium별로 분류되는것인지도 궁금합니다.
회원작성글 PORI  |  08.18
Q. DNA Extraction buffer 조성의 해석
안녕하세요   Cell에서 Cytosolic 미토콘드리아 DNA를 분리하려고 한 논문의 버퍼조성을보고 있습니다..   논문 내용은 그대로 적어드리면 Buffer A (100 mM Tris.HCL, pH 8.5, 5 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% SDS, 200 mM NaCl, 100 ug/mL proteinase K)   Buffer B (150 mM NaCl, 50 mM Hepes (pH 7.4), and 25 ug/mL digitonin)   이렇게 되어있고 저는 이 두개버퍼를 만들어야 합니다   그런데 제가 이해하기로는 최종 버퍼의 조성이 저러저러하다라고 보고 최종 볼륨에서 저 농도에 맞게 만들면 되겠구나 생각했는데요  pH가 여러개네요... 제가 가진 Tris, EDTA, Hepes는 모두 가루시약입니다.. 가루시약제품 자체의 pH를 말하는것인가요..?
회원작성글 ELFAMA  |  08.18
Q. real time pcr ct값이 이상합니다 도와주세요
안녕하세요 실험 햇병아리 대학원생 입니다! GAPDH 의 경우 어느 sample이든 CT값이 15-16정도 나오지만 target gene의 경우 scr sample은 CT값이 28, siRNA를 treat한 sample들은 CT값이 25정도 나와서 siRNA을 쳤는데도 불구하고 efficency가 내려가지 않고 오히려 올라가는 상황을 보입니다ㅠㅠ시약을 바꿔도 Sample을 다시 뽑아도 같은 결과가 나옵니다ㅠㅠㅠ 이유를 아시는분 있을까요? 도와주세요ㅠㅠㅠㅠ
회원작성글 살려주세요  |  08.18
Q. dCT? ddCT?
qRT-PCR 결과 해석할 때 dCT, ddCT 방법 이해가 조금 어려워서 문의드립니다. 찾아보니까  delta CT 는 target CT - housekeeping CT 라고 하는데 2^-dCT 는 그러면 housekeeping gene 대비 target 하는 gene의 발현량만을 구하는 건가요? dCT 에 마이너스가 붙는 이유는 무엇인가요...? 그리고 ddCT 방법을 쓰는 목적도 알고 싶습니다..  
회원작성글 hazzy  |  08.17
Q. 희석하는법 도와주세요 급합니다
안녕하세요. 아직 희석 농도 구하는게 익숙치 않아서 질문 드려요ㅠ 도와주세요.. 두가지 상황이 있습니다. 1. 12개의 서로 다른 100마이크로몰 샘플을 섞어서 2마이크로몰 500마이크로리터를 만들려고 합니다. 2. 5개의 서로 다른 100마이크로몰 샘플을 섞어서 2마이크로몰 500마이크로리터를 만들려고 합니다. 샘플과 DW를 몇씩 넣어야 하는지 이해시켜주세요..ㅠㅠ  
회원작성글 도와줘욤흑흑  |  08.17
Q. dsRNA RT-PCR하려고 하는데 denaturation 단계가 궁금합니다.
제가 따라하려고 했던 논문에서는 dsRNA를 RT-PCR시에 Random hexamer + dsRNA mixture 를 95도에서 5분 정도 denaturation 후에 RT-PCR mixture (random hexamer 제외)를 넣고이후 과정을 진행하면 된다고 적혀있었는데요. 찾아보니까 또 다른데서는 dsRNA만 denaturation 후에 RT-PCR mixture를 넣으면 된다고 적혀있더라구요.  그런데 qPCR시, ct값에서 denaturation에 따른 차이가 나타나지 않아서요.. 제가 denaturation을 잘못하는건지 궁금해서 이렇게 여쭤봅니다. dsRNA를 RT-PCR시에 denaturation 단계를 어떻게 진행해야 하나요??
회원작성글 soor  |  08.17
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