20ml로 cell을 키우고 다운시켜서 3가지버퍼를 차례로 넣고 돌렸는데 다운된 셀이 젤리처럼 되었습니다. 왜 그런걸까요?ㅠㅠ

구강상피세포 dna추출 과정입니다. 구강 상피 조직 세포 수거 과정 ① 면봉으로 뺨 안쪽을 누르듯이 긁어 구강 상피 조직 세포를 수거한다. ② 공기 중에서 약 2분간 말린 후, 머리 부분만 가위로 잘라1.5mL-튜브에 넣는다. 2) 용해 과정 ① T1 200μL를 솜이 잠기도록 넣고 단백질분해효소K 20μL를 넣은 후, 교반기로 약 5초간 잘 섞어준다. *T1= pre lysis완충용액 ② ①을 원심분리기로 가라앉힌 후, 56℃ 항온수조에 10분간 둔다. ③ 면봉을 제외한 용액을 1.5mL-튜브로 최대한 옮긴 후, B3 200μL를 넣고 교반기로 약 5초간 잘 섞는다. *B3 =lysis완충용액 ④ 원심분리기로 가라앉힌 후 70℃ 항온수조에 약 5분간 둔다. ⑤ 상온에서 약 5분간 식히거나 얼음에서 식힌다. 3) DNA 침전 및 추출 과정(부착 → 세척 → 건조 → 추출) ① 무수에탄올 200μL을 넣고 교반기로 혼합한 후, 수 초간 원심분리하여 튜브의 뚜껑에 묻은 것까지 모은다. ② 부착: 1.5mL-튜브 안의 용액을 콜륨 튜브로 옮긴 후, 원심분리기로 가라앉히면 콜륨 튜브 내의 막에 DNA 등이 부착된다. ③ 세척: B5 200μL을 넣은 후, 약 1분간 원심분리한다(2회 반복). *B5= washing 완충용액 ④ 건조: 1분간 원심분리하여 DNA를 완전히 말린다. ⑤ 콜륨 튜브 아래의 원통형 튜브는 버리고 1.5mL-튜브를 끼운다. ⑥ 추출: BE 20μL을 콜륨 내의 막을 향해 넣고 1분간 세워둔 후, 2분 동안 원심분리기로 가라앉히면 DNA가 추출된다.   이 과정에서 질문이 Q1.  용해 과정에서 56℃, 70℃의 항온 수조에 담근이유를 저는 56℃는 단백질 활성온도, 70℃는 핵산분해효소 변성시켜 불활성화하기위한 온도라고 생각했는데 맞는걸까요? 또한  Q2. DNA 침전과정에서 B5 완충 용액은 염을 제거하기 위한 과정일까요 단백질을 제거하기 위한 과정일까요?? 전반적인 과정이 단백질분해효소K를 처리는 하지만 페놀클로로포름 추출법같이 단백질분해효소K같은 처리한 단백질을 제거하는 과정이 없어서 혼란스러워요

gDNA를 추출하여 0.8% agarose gel 전기영동을 진행하였는데 band가 삐뚤게 나오고 밑에 나온 밴드는 무엇을 의미할까요?ㅜㅜ 불순물이 존재하는 것인가요? 0.8% agarose gel (1X TAE이용) / 100V / 1h  

sfi1이 뭔가요 ?? 제한효소 할 때 , sfi1처리 후 PCR purification 했다는데  저게 무슨 말 인가요 

어류 정소에서 DNA를 추출하는데  protamine 함께 나옵니다. Protamine을 분리해 내는 방법 좀 알려주시면 감사하겠습니다.

안녕하세요. 혹시 예쁜꼬마선충으로 실험 진행하시는 분 계신가요? 전 대학원생 진학 준비중인 학생인데, 예쁜꼬마선충으로 실험을 진행하고 있습니다. 저와 같은 입장이신 분과 소통하고 싶어서 글 올립니다.

 안녕하세요,   기존에 E.coli에서 Co-transformation을 위해선 각기 다른 Origin과 항생제 내성을 갖는 Vector를 사용할 경우에 문제가 없다고 공부를하여서요 ..   그렇다면 Mammalian cell에서는 어떤지 궁금하여 유경험자들의 조언을 얻고싶습니다.   제가 공부한 바로는 SV40 Origin을 갖는 경우 SV40 Large antigen을 발현하는 Cell line 에서 Replication이 되도록 설계되어 있다고 알고있습니다.   그렇다면 한 세포에 같은 Origin vector with different insert를 Transfection 시켜줄 경우에 문제없이 발현이 될 수 있을까요 ?   귀하신 의견 기다리도록 하겠습니다.   모쪼록 건강 유의하시길 바랍니다.   항상 감사드립니다. 

 안녕하세요, Reference에 나와있는 Interaction 하는 단백질을 발현 정제 하려고 하고 있는데요.   Reference에 pTYB12와 pACYC184 두가지 Vector를 사용하여 Chitin으로 정제 하였더라고요.   근데 문제는 두가지 벡터 모두 더이상 NEB에서 취급하질 않아서요 ..   그래서 시중에 판매하는 제품들을 찾아보니 pET Vector와 pSTV28 Vector가 origin이 각각 pBR322와 p15A로 Compatible 해 보이는 Vector를 찾게되어서 두가지 벡터로 대신 발현 정제해도 괜찮을지 여쭈어 봅니다..   아울러 귀한 말씀들 큰 힘이되어 도움 많이 받고있음에 감사드립니다.   심란한 정세에 모두 건승하시길 바라겠습니다. 

DNA mini perp 후 nano drop 정량하는데 문제입니다... trouble shooting 하는데 고민이 됩니다. 5개의 plasmid를 프렙 후 정량했는데, 260/280은 1.8보다 낮게 나와 EB가 날라가지 않은 것 확인 하였고 260/230은 한 개의 샘플은 1.14, 네 개의 샘플은 2.5부터 6.39까지 너무 높게 나와 가장 높게 나온 샘플만 다시 진행하였습니다.. 그런데 다시 하니 오히려 13.77이 나오더라구요. 찾아 보니 DNA degradation때문이라고 하는데 이를 줄이려면 어떻게 해야 하나요? 프렙 과정 중 스핀다운 중간중간에 다른 사람이 센트리 사용하여 버퍼에 조금 오래 담가 둔 일이 있고, 이 외에는 에탄올이 남아있는 것 이외에는 딱히 짐작이 가지 않습니다. 꼭 좀 도와 주십시오,,,ㅜㅜ  

PCR 한 후 gel purification을 하고 농도를 측정했더니 50ng/ul가 되지 않아요 sequencing 을 보내야 하는데 그냥 보내는게 나을지 아니면 gel puri한 product를 가지고 PCR을 다시 하고 PCR purification 해서 농도를 높여 sequencing을 보내는게 나을까요?

안녕하세요 plamid DNA 추출시 수율에 관한 질문입니다. 이번에 새로 실험에 사용할 vector가 있는 균주를 해외업체에서 구매했습니다. Plasmid DNA를 얻기위해 실험실에서 사용하는 kit를 이용해서 miniprep을 진행했는데 균의 양은 충분함에도 불구 하고(처음 균을 모으는 과정에서 눈으로 확인) plasmid DNA 농도가 40ng/ul 정도가 나왔습니다. 제가 miniprep 할때는 평균적으로 150~250ng/ul가 나오는데 40ng/ul가 나와 kit에 문제가 있나 싶어 다른 균주로 miniprep을 해본 결과 plasmid DNA농도는 150~250가 나왔습니다.  제가 선택한 colony가 혹시 문제가 있을까 해서 총 4개의 colony를 대상으로 해봐도 결국 농도는 여전히 50ng 이하였습니다.  현재 사용하는 항생제농도가 문제가 있을까 싶어 항생제가 없는 LB배지에서 배양해도 DNA농도는 여전히 그대로였습니다. plasmid를 DH5a균주에 넣어서 새로 클로닝하려 해도 vector내에 ccdB gene이 있어 불가능할꺼 같아 문제를 해결하고 싶어 질문드립니다. 추후 실험 진행시 plasmid DNA의 농도가 높아야해서 최대한 높은 농도로 추출하고싶습니다.  지금 제가 생각하는 차선책은 많은 양의 액체배지에 균을 배양해 한곳에 모아서 높은농도의 plamidDNA를 얻는 방법이라고 생각합니다. Vector size는 16kb이며, vector는 대장균에 들어가있습니다. 

환경표면에서  swab으로 채취한 10ml의 시료에서 qPCR을 통한 바이러스 확인을 하려고 합니다. PEG법 진행 시 pH농도를 맞춰주고 클로로포름이 들어가던데 꼭 필요한 과정인가요??? pH농도를 맞추는 것과 클로로폼의 역할이 궁금합니다. 그리고 제가 채취할 시료에 박테리아와 바이러스가 함께 있는 상태일 텐데 분석하는 바이러스가 용원적인 특성이 있습니다. 그래서 처음에 원심분리하여 상층액을 채취하여 박테리아를 제거하는 과정없이 바로 침전법을 사용하여서 이후 DNA를 추출하고 qPCR을 통해 확인하려고 하는데 이래도 괜찮을까요??

  슈퍼코일DNA 추출하기 위해 실험을 진행을 했어요.(CsCl-EtBr 사용) 초원심분리 후에 주사기로 빨간 라인을 뽑았고 EtBr제거를 위해 butanol을 사용하였습니다. 그런데 butanol with saturated NaCl 7ml 정도를 파이펫에이드로 넣고 흔들었어요.  여기서 질문은  butanol with saturated NaCl를 사용했는데 보니까 어차피 층이 분리되어있더라구요. 그런데 왜 윗부분만 사용하는지 궁금합니다..!!

보통 PFGE를 할 때 육각형 모양으로 생긴 장비에서 전기장을 60도씩 돌려주면서 한다고 알고 있는데, 일반적인 DNA gel electrophoresis 장비에서 전기장의 방향을 위아래로 바꿔주면서 하는 것도 PFGE라고 하나요? 만약 그렇다면, 그 결과는 어떤 형태로 나오게 되나요?   실험목적은 DNA fragmentation 정도를 확인하기 위함입니다.

plasmid 뽑기 위해서 LB에 colony 넣고  밤에 shaking incubator를 돌렸는데  아침에와서 보니 heat이 안켜져있더라구요.. 그대로 다시 heat을 키고 사용해도 될까요? 아니면 새로 뽑아서 넣어야 할까요 ? ㅜㅜ

안녕하세요 배지에서 배양한 진균 DNA 추출을 하고 있는데 solgent사 키트는 액체배지를 말하고 있더라고요. 한 번 액체배지와 고체배지 둘 다 실험해 보았는데 오히려 액체배지는 dna pellet이 잘 안 보이고 상층액을 버릴 때도 남아있는지 모르겠습니다. 혹시 액체배지에서 분리할 때 먼저 망에 거른다던지 방법이 있어야 할까요?

우선 연구활동에 이제 입문해서 많이 부족한 점 양해 부탁드립니다. 1. dna 추출 과정에서 cell lysis를 이용하고 nuclei lysis 이용해서 세포막, 핵막을 파괴하는 걸로 알고있습니다. 세포막과 핵막의 어떤 성분이 다르기때문에 두가지 시약을 따로 사용하는 것인지 궁금합니다. 2. 또 dna 추출과정에서 iso propyl(저는 2-propanol 사용)이 어떤 역할로 dna를 응축 시키는지 알려주시면 감사하겠습니다.  

DNA 플라스미드를 추출하여 Nano Drop으로 농도와 흡광도, 순도를 측정하였습니다. 그니까 260nm에서의 흡광도와, 260nm,280nm 흡광도의 비(순도), 농도(ng/ul)값을 알고있는 상태입니다. 저것들을 토대로 추출한 플라스미드 DNA 용액의 부피를 알 수 있는 방법이 있을까요? 부피는 실험할때 측정했어야 하는거 아닌지 ...모르겠어서 질문드립니다.ㅠㅠ 

새로 구매하려고 하는데 기존 쓰고 있는 곳은 연계업체가 납품을 제대로 안해주셔서 바꾸려고 합니다. 좋은 mini prep kit 있을까요?

안녕하세요 이번 학기 석사 입학한 신입생입니다 실험 진행하는 중에 기본적이지만 처음이라 감이 잘 안잡혀서 이 곳에 도움 요청드립니다. methylation 관련 실험을 진행하기 위해 sigma 제품 imprint methylated dna quantification kit이 구입된 상태이고 protocol을 읽어보던 중에 궁금한 점이 생겨 질문 남깁니다. DNA sample을 가지고 실험을 해야 하는 것 같은데 1. DNA prep kit는 quiagen 제품 DNA mini kit를 사용하면 될까요? 2. methylation kit protocol 상에서 DNA 또는 genomic DNA라고 두 종류로 표기되어있는데 그냥 DNA prep kit를 사용하면 될까요? 아시는 분은 꼭 답변 부탁드립니다ㅠㅠ