이번에 immunocytochemistry 처음 하려고 합니다. Ab처리나 blocking & washing 과정을 shaker에서 해야하는지 아니면 처리를 해두고 그냥 나둬도 되는지 궁금합니다. 혹시 흔들릴 경우에 cell이 떨어지지 않을까 해서 걱정이 됩니다. 그리고 normal goat serum이나 BSA를 쓴다고 하는데 skim milk를 안쓰는 이유가 효율면에서 더 좋아서 사용을 하는 건가요? 아님 다른 이유라도 있는지..... 역시 쉬운 실험은 없는것 같습니다. 준비해야 될께 많네요.... 그냥 넋두리였습니다.ㅋㅋ

안녕하세요. FACS를 해야 하는 상황이 발생했는데, 구글 여기저기서 protocol은 구했습니다만, 몇가지 감이 다가오지 않는 것이 있어서 여쭤봅니다. 일단 staining 할 target 단백질은 intracellular protein이구요, cell이 adherent cell인데, 일반적인 culture 하듯이 트립신으로 쎌을 띄고 culture medium(serum 포함된)으로 트립신 reaction 스탑시키고... 이후에 tube로 옮겨서 staining 하면 되는 걸까요? 또다른 질문은... 실험실에서 immunocytochemistry는 많이 하지만, FACS는 한번도 안해서.. FITC, TRITC, AMCA, Cy5 가 있습니다만, 이 secondary antibody를 이용해서도 FACS가 가능한가요? 지금 double 내지는 triple staining 을 해야 하는데... 이 secondary antibody들이 안된다면, 빌리거나 새로 사야 하는데, 잘 모르겠어서 여쭤봅니다. 공동기기실의 FACS는 FACScalubur와 FACS canto 가 있습니다. 또 sorting이 되는 FACS aria II 가 있습니다. 처음 할 일을 해보는것은 언제나 좀 여럽네요. ^^;

갑자기 실험을 하다가 궁금증이 생겨서 질문 드립니다. co-IP를 할 경우에 cell lysis 과정을 통해 전체 단백질을 얻습니다. 정말 A 와 B가 상호작용을 한다면 세포를 lysis하더라도 두개가 같이 붙어서 존재를 할 수 있는데 만약에...... 서로 떨어져서 있다가 우연히 lysis buffer조건에 의해서 두개가 서로 붙을 수도 있지 않을까 하는 생각이 들어서 질문 드립니다. 어떻게 보면 co-IP보다는 immunocytochemistry나 IHC 를 통해 본 실험에서 같은 위치에 존재를 한다는 결과가 더 정확한 실험이 되질 않을까요? 님들은 이런생각을 해보셨나요? 의견을 듣고 싶습니다.

Immunocytochemistry를 처음 시도하려고 합니다. 과정 중에 normal goat serum으로 blocking을 한다고 알고 있는데 어느 회사 제품을 쓰면 되나요? 종류가 많아서 좀 헷갈리네요. 추천 부탁드립니다~

전에 했던 ICC실험을 이번에 다시 해야해서 질문드려요.. immunocytochemistry할 때, 1차 항체 2개와 2차 항체 2개(빨강, 초록) 이렇게 해서 할려고 하는데요. 전에 1차 항체 붙일 때 두 개를 blocking solution에 섞어서 4도에서 overnight했다고 하니까 놀라시더라고요..전 논문이나 여러 싸이트를 찾아봤을 때 따로 했다고 한건 하나도 못봐서 그렇게 한거거든요... (물론 2차 항체도 위처럼 섞어서) 그래서 예전에 실험이 뚜렷이 안나왔나 하는 생각도 들고요. 고수님들은 어떻게 하시나요?? DAPI는 물론하고, 1차 항체와 2차 항체가 2개씩일 때, 어떻게 incubation시키나요? 꼭 알려주세요~~

Primary culture한 후 10일,14일된 Neuron Cell에서, 한well에는 C-LTP를 유도하는 chemical을 넣고 다른well에는 negative control로 sodium channel을 Blocking하는TTX를 처리해서 Immunocytochemistry를 하여 transcription factor인 egr-1의 변화등을 비교해보려고 합니다. 그런데..TTX의 처리양을 어떻게 해야할지 잘 모르겠네요. 논문에는 300nM이라고 적힌 게 있긴 하던데 좀 더 구체적인 내용을 알았으면 합니다.찾는다고 해봤는데 잘 모르겠네요..

세포염색하는 과정에서 질문드립니다. Marienfeld 18mm No.1 glass coversilp제품을 사용하려고 하는데 괜찮은거죠?^^;; 그리고 세포를 plating하고 PFA고정한 다음에는 6well에서 petri dish같은데로 옮겨서 하라고 되어있는데 그냥 6well상태에서 하면 안되는 건가요?^^;;; 답변 부탁드립니다.

저는 단지 antibody의 퀄리티때문에 구분해놓은줄 알았는데 어떤 antibody는 WB에만 어떤 antibody는 immunocytochemistry에만 어떤건 둘다 써도 되고 그렇군요~ WB에 써도 되는 antibody의 특징과 immunocytochemistry에 쓰이는 antibody의 차이를 알고 싶습니다.

제가 cell 표면에서 receptor 발현을 보고자 그 receptor 에 대한 antibody 을 구해다가 면역염색을 하고자 하는데, antibody 가 paraffin-embedded sample을 이용하는 immunohistochemistry 용으로만 출시되어잇드라구요, 이 antibody 을 구입해다가 Immunocytochemistry 용으로 사용해도 무방할까요? 혹시나 면역염색을 제외한 다른 방법으로 cell 표면에서의 receptor 발현을 볼수있는 좋은 실험방법은 없을까요? 많은 조언 부탁드립니다.

immunocytochemistry를 진행하고 있는데, DNase I를 사용하는데도 DAPI 염색이 됩니다. 새로 구입한 DNase여서 활성은 문제 없을걸로 생각되고, DNase I와 함께 incubation bfr가 들어있습니다.(Roche 제품) enzyme과 bfr를 합하여 DEPC water로 make up하여 activation(25~37도, 10분)시켜 사용하도록 되어있습니다. fixing (fixing bfr와 함께 25도, 30분씩 2번)단계에서 DNase를 넣어 주는데, 제가 사용하는 fixing bfr와 함께 사용해서 일까요? 많은 조언 부탁드립니다.

Cell(HUVECs)을 가지고 처음으로 immunocytochemistry를 진행 하려고 하는데요. 자세하고 구체적으로 정리된 protocol 가지고 계신분 있으시면 좀 도와주세요. 참 막막합니다. cell을 어디에 plating 하는 기본적인 것부터 부탁드립니다. 여러 검색 사이트에서 찾아보았는데 없어요... 좀 도와주세요.

안녕하세요 마우스 T cell에서의 intracellular calcium 을 보고자 합니다. 그러니깐 이 세포안에 칼슘이 있느냐 없느냐만을 보고싶은데 calcium influx 실험이 보통 어떤 자극을 주고 칼슘을 측정하는것이잖아요... 그런데 단순히 그 세포안에 칼슘만을 detection 하고 싶은데 그 방법좀 알려주세요... 혹시 confocal로 찍으면 마치 immunocytochemistry를 한것 처럼 그렇게 볼 순 없을까요? 참... 그리고 한가지의 질문 더요^^ cuvette 안에 같이 넣는 calcium free buffer (?) 의 조성은 어떻게 되는지 궁금해요 처음 하는거라.. 막막해요 선배님들의 조언 부탁드립니다~

immunocytochemistry와 관련된 여러가지들을 setting중에 있습니다. 당췌 이런 것들을 해본적이 없어서.. 저희방은 animal cell을 confocal로 찍을려고 하는데요 보통 cell을 키울때 cover glass에 cell을 키우는데 이 cover glass 어디것을 쓰시는지요? 회사랑 제품 추천바랍니다. 조금 상세히요..

NF-kB activity study와 관련하여 translocation되는것을 볼려고 합니다. immunocytochemistry와 wstern blot(nuclear/cytoplasm)을 하려고 합니다. 그래서 p65 antibody를 주문할려고 하는데요 phospho-p65를 써야 하나요? 아니면 native한 p65를 구매해도 상관 없는 건가요? 제가 본 대부분의 논문에서는 phospho-p65 Ab에 대한 언급이 되어있질 않았거든요 자문 부탁드립니다.

immunocytochemistry하는데 항상 Lab-Tek™ II CC2™ Chamber Slide™ System(nunc)를 사용했어요..polylysine이 mimic한 것을 사용했는데요.. 다 사용하기 전에 주문했는데 자꾸 백오더 나고 그래서 2월 초에 온다는 게 3월초까지 기다려야 해요.. 그래서 질문할 것은... 이거 말고 그냥 Polystyrene cover 되어 있는거 사면 안되는 건가요?? 기초적인 질문 같지만.. 논문들에선 poly-D-lysine Lab-Tek Chamber Slide (nunc)사용했다고 나오는데.. 찾아봐도 없고 이건 없고요.. 그럼 어떻게 해야 하는건가요??

IRS-1에 대해 immunocytochemistry를 하고 있어요.. 지금 몇 번 했는데도 불구하고 진하게 안나오고 흐릿하게만 나오네요.. IRS-1 1차 Ab - santa cruz (sc-7200) 2차 Ab - santa cruz (goat anti-rabbit IgG TRITC으로 cat.no : sc-2091) 로 하고 있는데 잘 안되요.. 좀 진하게 잘 나오는거 추천 부탁드려요.. (그 전에 fixation도 다르게 해보고, Ab dilution도 다르게 해봤는데 다~~똑같이 안되요ㅠㅠ) 물론 논문을 봤는데요.. upstate로 쓰는 논문들을 봤는데, 워낙 Ab가 비싸서 신중히 결정할라고요..(1차 Ab바꿀까 생각중;;;;;) 꼭 답변 부탁드려요.....

immunocytochemistry 실험을 할려고 secondary antibody를 알아보다가 종류중에 goat anti-mouse lgG와 goat anti-mouse lgG highly cross absorbed라고 나와있더라구요, highly cross absorbed는 무엇을 말하는건가요? 그리고 이 두 제품의 차이가 많이 나는건가요?

초파리 세포를 가지고 실험을 할려고 하는데 초파리 세포가 plate의 바닥에 부착된 상태로 자라는게 아니라 거의 떠서 자라는 타입입니다. 이세포를 가지고 immunocytochemistry를 하려는데 coverslip에 고정시키거나 다른 방법을 찾아봐야 할텐데 어떻게 해야 하는지 잘 모르겠습니다. 논문을 찾아보면 제가 키우고 있는 세포가 마치 바닥에 붙어 자라서 일반 세포와 같은 방법으로 설명되어 있는데 그렇지 않아 고민입니다. 조언부탁드립니다.

HeLa cell을 가지고 Immunocytochemistry를 하고 있습니다. 그런데 마지막 step에서 mounting solution(vector shield)에 cover glass를 덮은후 시간이 조금 지나면 많은 부분이 하얗게 되는데 이를 현미경으로 보면 마치 서리가 내린듯 결정화가 일어나 세포의 morphology를 구분하기가 힘듭니다. 때때로 그렇지 않은 경우도 있고 같은 시간에 실험을 한 몇개의 샘플중 정도가 조금씩 다르기도 하는데 왜 그럴까요? 조언 부탁드립니다.

MDCK cell 또는 Caco-2 cell 배양 실험 하는 곳을 찾습니다. polarized cell에서 저의 관심 단백질의 세포내 분포가 polarized distribution을 보이는 결과를 immunocytochemistry 후 confocal section으로 얻고 싶습니다. 직접 하시거나 주변에 하시는 분을 아시면 알려 주시면 감사하겠습니다. 혹은 이와 같은 목적으로 실험결과를 얻을 수 있는 다른 방법이 있으면 알려 주세요. 감사합니다.