cell을 osmotic shock으로 깨려고 합니다. 그런데 바로 깰수가 없어 보관을 하려고 cell을 centri 후 PBS로 wash하여 pellet으로만 보관을 하려고 합니다. 그런데 이때 -70도에서 보관을 하게되면 cell이 얼게되고, 꺼내는 순간 녹으면서 cell membrane이 깨질지는 않을까 걱정이 되어 질문드립니다. osmotic shock으로 cell을 깨려는 경우, 그 전 단계에서 보관을 어떻게 하면 좋을까요?

저희 실험에서 한 실험당 50ug 정도의 GFP plasmid를 이용하는데요. 농도가 2800ng/ul정도 됩니다. 지금 가지고 있는 플라스미드를 E. coli에 transform 시켜서  클로닝하고 고농도로 뽑아내려고하는데. 다른 연구원분께서 해보았을때는 100ug/ul정도밖에 나오지 않아 실험에 쓰기는 힘들다고 하십니다.   고농도로 플라스미드를 뽑을때 쓰는 키트가 있다고는 들었는데 이게 대용량인지라 원심분리기에 넣을 튜브 볼륨이 상당히 큰데 저희과에서 쓰는 건 50ml가 최대인지라 키트를 사더라도 이용이 어려울 듯 합니다.    지금 쓰고있는 GFP 플라스미도 전에 계신 박사님이 추출한 것이라고 하는데 지금 연락이 어려운 상황이라...   그런데 그 당시에는 지금 저희 실험실에서 쓰는 키트도 없었을 거라고 하셔서 혹시 일반적으로 쓰는 키트로 고농도 플라스미드를 추출할 방법이 있는지 알고싶습니다.

쓰는 키트는 Q사의 QIAamp DNA Mini Kit 를 사용합니다. 고체 배지에 배양된 균 colony를 따서 균의 DNA를 키트의 프로토콜대로 추출하는데 계속 순도 1.8~2.1 사이에선 10 정도의 낮은 농도만 나오고 순도가 1.7이나 1.6 정도로 떨어지면 바로 농도가 100이 넘게 나오고 있습니다.   lysis 반응의 시간을 늘려 보거나 시료의 양을 늘려보고, 새 키트로 교체 해보거나 새로 계대배양 해서 균을 다시 따보거나 마지막 Elution 과정에서도 다시 spin column에 뽑아서 넣어서 2~3차례 반복하기도 해봤지만 계속 이 문제가 발생합니다.

cloning과정중 목적유전자 pcr을 하기위해 pcr primer를 design 하려고 하는 학부생입니다! 원하는 목적유전자 염기서열 앞에 제한효소자리가 생기도록 제작하였는데요 각각의 제한효소인식부위 앞에 추가적으로 두세개정도의 염기를 더 붙여서 제작해야한다고 들었는데 이 추가적으로 붙여주는 염기가 어떤 역할을 하는지가 궁금해 질문드립니다. 찾아보기로는 인식부위와 안정적인 결합을 위해서라고 하든데 잘 이해가 되지 않아서요

선배님들 안녕하세요! 생명과학을 공부하고있는 대학생 입니다. 굉장히 간단한 질문같아보이는 내용은 고명하신 선배님들의 의견을 여쭙고자 해서 입니다.   저희 학교 수업 중 집에서 브로콜리 DNA를 추출해야 하는 과제가 있었습니다. 해당 실험 진행 프로토콜은 유튜브에 있는 영상을 참고하였습니다.   그런데 유튜브에서 DNA를 뭉치게 하기 위한 소금물의 농도를 8% 혹은 9%로 정량하더군요, 예를 들면 9g의 소금을 물100ml에 넣어 섞더준다는 방식이었습니다.   교수님께서는 박테리아의 경우 8.xx%, 동물 식물세포에서는 9.xx%가 등장액이기 때문에 해당 염 퍼센트농도를 사용한다고 설명해주셨습니다. "등장액의 소금물 농도는 세포막이 터지는 것을 막아주고 DNA와 결합하여 침전을 도와준다"라는 것이 교수님과 유튜브의 설명이었습니다. 여기서 저는 의문이 들었습니다.  결국 DNA추출하려면 cell lysis를 해야 하는데 왜 굳이 등장액 농도를 맞춰주어야 하는가 입니다. 그래서 관련 자료를 찾아보려 구글링 해보는데, 외국의 실험 경우 소금을 정량하지 않고 넣는 경우가 많았고 3.5%의 저장액을 사용하여 DNA를 추출하는 실험도 보았습니다.    그래서 저는 이 실험이 왜 9%의 NaCl수용액을 사용해야하는지에 대한 의문이 풀리지 않았고 이 내용과 관련하여 선배님들의 의견을 여쭈어보고 싶습니다. 1) 9%의 NaCl 퍼센트 농도를 반드시 사용해야하나요? 2) 아니면 정량하는 의미보다는 그저 한 스푼의 소금을 넣는다는 방식으로 실험진행이 가능한가요? 3) 아니면 저장액을 사용하여 DNA를 추출해야 할까요?   내용 읽어주셔서 감사합니다.  

  둘다 washing buffer로 알고 있는데 PW 용액은 DNA를 씻어내리지 못하지만 EB 용액은 씻을 수 있는 이유가 뭔가요? 원리가 궁금합니다...!

안녕하세요.. 실험 도중 궁금한 점이 생겨 선배님들의 도움을 받고자 글을 올리게 되었습니다.. 현재 현미경관찰을 위하여 투명셀로판테이프를 통해 slide glass에 기생충 eggs을 붙여 고정시켜둔 샘플이 있습니다. 크기는 100x35um 정도 인데..현미경 없이 육안 관찰은 힘든 상태입니다.. DNA 추출 후 pcr 및 gel loading을 해보려 하는데 효율적이게 DNA를 추출할 수 있는 방법이 혹시 있을까요..? 노하우를 기다리겠습니다.. 미리 감사드립니다..!

Nacl 대신 sodium acetate나 potassium acetate를 넣어줘도 문제가 없을까요?

0.7% agarose gel을 이용한 electrophoresis 후에 밴드가 뜬 부분의 gel을 따로 얻어서 gene clean을 하려고 합니다. 얻고자 하는 DNA의 크기는 7kb 정도입니다.  kit를 이용해서 DNA를 얻을 때 1kb 이하인 것을 얻을 땐 수율이 좋은데 꼭 큰 애를 얻으려고 할 때는 수율이 좋지 않습니다.  스탭이나 단계에서 제가 더 주의할 점이 있을까요? 아니면 노하우가 있으신 분들은 공유 가능하면 부탁드립니다 ㅠㅠ

안녕하세요. Plasmid DNA preparation 중 isopropanol에 elution하여 centrifuge 후 침전된 DNA pellet 을 EtOH washing 하는 단계에서  70% EtOH가 아닌 100% EtOH를 사용하였습니다.  원래대로라면 pellet이 유지되어야하는데 100% EtOH를 넣자마자 DNA pellet이 풀어졌습니다.  왜 이렇게 되는건지 찾아보니 Salt가 없고 EtOH의 농도가 높으면 DNA pellet의 물분자가 빠져나간다는데 이와 관련이 있나요? 아니라면 왜 이렇게 되는 건지,  DNA를 다시 centrifuge 하고 washing하여 pellet을 얻을 수 있었는데 정상적인 pellet과 달리 더 하얗고 불투명해졌습니다. 70% washing하여 사용해도 되는지 알고싶습니다.    조언 부탁드립니다.  감사합니다. 

안녕하세요, 대학교에서 처음 생명과학을 접하게 된 학부생입니다. 진행하는 실험에서 등장하는 용액들의 기능을 여쭙고자 글 올립니다. 실험은 DNA extraction이고 조사 해보니 실험 키트는  https://www.intronbio.co.kr:6002/intronbio/product/product_view.php?PRDT_ID=8&page=1&Scate1=2&Scate2=1&Scate3=1&Scate4=-321-&Scate5=&Scate6=&Sword= 이거더라구요. 여기에서 나오는 protocol A와 저희 학교 실험내용과 거의 일치하더라구요. 근데 material의 기능은 알 수 없어 여쭙고자 합니다. Proteinase K RNase A Buffer BL Absolute Ethanol Buffer WA Buffer WB DEPC 생명과학에 대해서 아는 지식이 거의 없어요... 고등학교 생1 생2 정도?? 친절한 설명 부탁드립니다 ㅠㅠ

안녕하세요 균에 존재하는 large plasmid를 agarose gel에서 확인하고자 합니다. 대략적인 size는 80kb입니다. overnight한 균주를 kit를 사용하여 miniprep하였고 0.5% agarose gel에서 3시간정도 내렸는데 well에서 빠져나오지를 못하는 것 같습니다. 사진을 보면 well아래쪽에 밝게 band가 보이고 전혀 내려가지 않습니다. 논문을 보면 잘들 내려가던데 무엇이 문제일까요??ㅠㅠ  

실험에서 사용되는 샘플이 많은 볼륨에서 매우 적은 농도의 DNA를 추출하여 PCR을 해야 하는 상황 입니다.   현재 PEG를 통한 농축과 원시료에 대한(전체 시료중 일부 소량만 취득하여 실험함= 오차가 심함) 테스트 결과 오차가 매우 심하여 다른 방법을 모색 중이나 DNA 를 추출하는 방법중 농축 이외 대량의 시료에서 뽑아 내는 방법이나 아이디어를 찾지 못해 문의 드립니다. 혹, 아이디어나 또다른 농축법이 있다면 추천 부탁 드립니다.

Restriction enzyme reaction 후에 gel elution으로 뽑았는데 loss가 많다고 PCI를 이용해서 하라고 하셔서 하는데 실험이 실패한 거 같아서 다시 제한효소 처리 중입니다 ㅠ 제한효소 처리한 plasmid 총 80ul를 d.w를 넣어서 500ul로 맞추고 PCI를 500ul 넣어서 1ml를 만든 후에 원심분리를 8000rpm으로 5분 하고 반복을 두 번 더 하라고 하는데 이때 상층액은 얼마 정도 뽑아야 하나요? 최종 supernatant를 450ul 뽑으면 된다길래 그렇게 하려고 했는데 자꾸 밑에 층에 팁이 닿더라고요... 그래서 점점 더 적게 옮길수록 마지막에 450ul 따는 건 불가능할 거 같은데... 그리고 마지막에 450ul 따면 총 볼륨 10%가 되게 50ul 3M NaOAc를 넣고 1ml 95% ethanol을 섞고 영하 80도 30분 보관하고 원심분리 12000rpm 30분하고 70% ethanol washing 하고 말린 후에 물 넣으면 된다는데 450ul 따는 과정까지 어떻게 해야 성공할 수 있나요? 반복하는 과정에서는 그냥 밑에까지 팁 안에 들어와도 신경 안 쓰고 반복해서 aqueous solution의 양을 늘린다는 느낌으로 하는 건가요?

안녕하세요 ethanol precipitation을 하려고 하는데요 PCI 이용 후 centrifuge를 돌리고 pellet을 확인했습니다. 이후 99% EtOH와 sodium actate, glycogen을 이용해 centrifuge를 돌리고 전기영동을 하는데요 agarose gel의 comb에 loading 시 용액이 가라앉지 않고 다 떠서 나와버립니다 그래서 제가 궁금한건 EtOH의 %가 높은건지 아님 상온에 보관되어있던 것을 사용해서 인지와 PCI 과정을 거쳐야하는지 만약 굳이 안 해도 된다면 다른 방법은 있는 것인지 입니다ㅜㅜ 도와주세요ㅜㅜ 

에탄올로 PBS용액으로 고정된 세포를 세척하는데 세척을 안하고 실험을 할 수는 없는건가요..?? 세척을 하는 이유는 뭔가요 ㅠ  

washing할때쓰는 버퍼중에 앱솔루트 에탄올을 적당량 섞어야 하는 버퍼가 있는데 이유가 있을까요???

miniprep하거나 maxiprep할 때 보통 Sol 1에 RNase를 첨가합니다. 만일 RNase 첨가를 빠뜨렸을 경우, Sol 1, 2, 3 처리하고 원심분리한 후 supernatant를 컬럼에 loading하면 제거되지 않은 RNA도 resin에 잘 붙겠죠? 그러면 resin 의 핵산 결합 capacity에 한계가 있으니 RNA가 붙은 만큼 DNA가 그만큼 적게 붙겠죠? 이런 경우 어느정도 효율저하가 될까요?. 경험있는 분 계시면 조언 부탁드립니다.

안녕하세요 DNA 추출을 배운지 얼마 안된 대학생입니다. TIANGEN 사의 TIANamp Marine Animals DNA Kit 를 사용여 gDNA를 추출하는 것을 배우고있는 과정중 이 kit는 silica membrane 원리를 근거로 DNA를 추출하는데  개면활성제 성분이 있는 LYSIS BUFFER로 LYSIS과정을 끝내고 DNA정제에서 단백질과 각종 이물질들의 활성을 억제하는 버퍼를 넣고 그 다음 ABSOLUTE ETHANOL을 첨가하고 vortex와 원심분리 후 과정이 이해가 안되서 질문드려봅니다. 이전 과정 후 silica membrane에 옮겨 담은다음 또 원심분리를 하게 되면  collection 튜브에 내려오는 용액은 lysis하고, DNA를 정제하고, DNA를 에탄올 침전까지 해서 더이상 필요가 없는 용액인건 이해를 합니다. [그다음에 silica membrane에 GD buffer (ABSOLUTE ETHANOL 17 ml 첨가 된)를 500 ul를 첨가하고 PW buffer(ABSOLUTE ETHANOL 50 ml 첨가) 600 ul 를 첨가합니다. 이 부분이 지금 이해가 안되요 ㅠㅠ]  저 GD buffer와 PW buffer의 정확한 원리를 알고 싶습니다. PW는 불순물과 단백질, 염을 제거하는 washing버퍼인 듯한데;; 잘모르겠습니다 ㅠ  저 이후과정은 TE 버퍼를 통해 상온 incubation 후 spin down으로 DNA를 추출합니다.

학부 연구생 경험 있는 예비 대학원생입니다. 방학 때 실험실에 나와 실험 보조를 하고 있는데 사수 분이 외국인이시고 현재는 휴가를 가셨습니다. Cell down 시키고 배지 제거하고 S1, S2, S3 buffer 넣으면 하얀색 부유물이 보이고 이걸 원심분리 하고 상층액을 따는 과정에 원심분리 후 여전히 남아있는 일부 흰색 부유물이 보입니다. 12000rpm에서 10분 동안 원심분리를 했는데도 둥둥 떠다니고 있어서 3분 더 해봤는데 여전히 있더라고요. 그래서 조심한다고 따서 다음 과정 진행했었는데 DNA 농도가 비정상적으로 엄청 높게 나왔고 전기영동 결과500bp 밑으로 smear 되어 gDNA 오염이 되지 않았나 싶습니다. 그런데 이전에 학부 연구생으로 alkaline lysis를 하면서 이런 경우가 없었던 거 같은데 왜 부유물이 남아있는 걸까요? S3 넣고 centrifuge 오래 해도 plasmid에는 문제가 안 생기나요? 이전 실험실은 kit를 사용하였고 버퍼도 250, 250, 250씩 사용했는데 여기서는 100, 200, 150 이렇게 넣습니다. 혹시 부유물이 벽면에 남아있다가 뜨는 걸까요? 실험실 메뉴얼이면 다른 분들은 다 괜찮았다는 걸텐데 혹시 이런 경우를 겪으신 분 중에 원인을 찾아내신 분이 있으시면 도움을 주셨으면 합니다 ㅠㅠ