분자검정 실험을 했습니다. 우유에 수단3를 넣고 6분이 지난 후 결과를 봤는데 빨간색으로 염색되어 부유하는 방울들을 보지 못했습니다. 왜 지질을 관측하지 못한 걸까요?

처음 셀을 dish에 seed하고 3~4일마다 미디어 교체를 해주지 않습니까.   미디어 체인지할때 dish에 깔린 cell들을 인큐베이터에서 꺼내고 클린벤치 안으로 가져오는 과정중에 dish 표면이 다 오염이 됐을텐데 별도로 dish를 에탄올로 소독하거나 알콜램프로 소독하지 않고(물론 열처리하면 cell들이 다 죽겠지만요) 미디어 교체를 진행하는 과정중에  dish 뚜껑과 바닥부분이 벤치 바닥에 필연적으로 닿게 될텐데.. dish의 안쪽만 오염되지않도록 조심하면 상관없는걸까요?     p.s 이런질문을 남기는 이유는 모든 기물들은 클린벤치 들어가기 전에 에탄올로 소독하거나 안에서 uv 멸균을 하는데  cell dish만 예외인거 같아서 질문남겨봅니다.  

HPLC를 이용해서 포도당함량 정량 분석을 해야하는데요... 제가 농도 계산에 너무 약해서 분석은 다 해놓고 어떻게 계산해야하는지 모르겠어서 이렇게 처음으로 글을 올리게 되었습니다 ㅠㅠ   그냥 지나가지 마시고 알려주시면 정말 감사드리겠습니다 ㅠㅠㅠㅠ   먼저 제가 Standard curve는 excel 통해서 그렸구요, 기울기가 1268215.9, 절편이 52715.0 이렇게 나왔습니다. 그리고 sample 6g(해당 sample에는 70Brix, 순도98% 짜리 액상 포도당이 총 배합비의 20% 첨가된 것으로 생각됩니다.)이 을 넣고 초순수로 100ml를 맞춰서 시료를 제조 하였구요, 해당 만들어진 용액을 마그네틱바로 20분 저어주고, 85℃ 항온수조에서 20분간 용출시켰습니다.   그리고 나서 해당 용액을 실린지 필터이용해서 샘플링 한 뒤, HPLC 분석을 하였더니, Area가 700653.2 나왔습니다.   문제는... 이 후, 이게 제대로 분석이 된 값인지... 그리고 이 Area값을 가지고 이 안에 얼마나... mg/ml 들었는지... 계산을 못하겠습니다.....ㅠㅠ X값으로 나오는 값이 단위가 mg/ml 인가요? standard curve 만들때 0.5~5%농도까지 만들었는데요... 헷갈리는 것 같아요 ㅠ 중고등학교때도 농도가 어려웠는데.. 지금도 너무 어렵습니다... 계산 방법을 간략히라도 알려주시면 너무 감사드리겠습니다 복 받으실거에요!! ㅠㅠ

pH = 3 짜리 phosphate buffer 를 만들어야 합니다.   water 에 potassium dihydrogen phosphate 를 넣은 후에 phosphoric acid 로 pH 맞추는 게 맞을까요?

현재 사용하고 있는 column은 c18 column입니다. 아세트아미노펜(sigma, 99%)을 단일 분석을 돌렸는데 Double peaks가 발생하고 카페인(sigma, <99.5%)도 단일 분석시에 tailing이 발생합니다. 그래서 개인적인 생각으로는 column 초입에 Blocked frit이 발생한 거 같은데 column의 flow 방향을 역으로 하여 washing 하는 방식으로 frit을 해결한다고 알고있습니다 따라서, 궁금한 점은 column의 flow를 역으로 연결 하였을 때 주의사항이 있을까요? 이동상은 ACN : Water (HPLC등급)을 사용하고 있습니다.

안녕하세요, 우선 제가 cell culture에 대한 가방끈이 너무너무 짧고 경험도 없어서 무지한 질문 드리더라도 이해 부탁드립니다..   제가 직접 만든 DMEM에 대한 sterility 정도를 확인하고 싶어서 균 접종 없이 약 66시간 정도 CO2 배양기에서 배양하였는데, 아래와 같이 부유물이 떠다닙니다. 혹시 이런 것을 보신 적이 있으신가요? 현미경으로 확인하면 이러한 모양입니다.   배율은 200x(또는 400x)로 기억합니다.. 작은 구 하나당 10~20 um정도 로 보였습니다   대체 이게 뭘까요? contamination 에 의한 것인가요?   0.1 sterile filter를 사용하고 sterile technique에 따라 작업했는데 오염이 발생했다는게 도무지 이해가 안됩니다..   더군다나, 이것과 동시에 10% FBS를 첨가하여 배양한 액은 이러한 부유물이 없습니다..   개인적인 사견으로는 co2 배양기에 넣음에 따른 pH 저하에 따른 calcium carbonate 침전이라고 생각되는데 이게 논리적으로 말이 될 수 있는 말인지요?   감사합니다..

attR1 --> attR4로 바꾸는 mutagenesis를 진행중인데, PCR 후 Dpn1처리 하지 않고 chlo를 도포한 Amp+ plate에서  ON 키웠더니 colony가 많이 떳습니다. 그런데, colony 양상이 매우 clear하고 작습니다. 그래서 PCR product에 Dnp1을 처리하고 다시 chlo를 도포한 Amp+ plate에서 ON 키웠더니 colony 비슷한 아이가 한 10개 정도 떳습니다.  그래서 걔들 중 3개를 뽑아서 밤새 Amp+ LB에서 키웟는데 거의 맹물 수준입니다 (chlo없어서 Amp+에서만 키웠습니다.).  원인이 무엇일까요? ㅠㅠ   그리고 Dpn1 처리 하지 않은 것에서 colony 따서 키운 후 sanger에서 가려볼 필요가 잇을까요?

안녕하세요 이번에 세포 증식실험을 계획한 학생입니다. 그런데 CCK-8 assay를 많은 논문에서 하고 있어 참고할 예정인데 제가 MTT, WST-1 등 의 실험은 해보았는데 혹시 논문의 결과들에서 24, 48, 72h 의 결과들은 한 plate에 seeding후 CCK-8 kit를 처리하여 계속 본건지, 세 plate에 같은 양의 cell을 seeding 한후 하나씩 시간마다 처리하여 본건지 궁금하네요. 답변해주시면 정말 감사하겠습니다!

western blot에서 gel에서 membrane으로 transfer 하는 이유가 뭔가요? 검색해보니까 SDS가 항체-항원 결합을 방해한다는 내용밖에 안나와서 자세한 기전이 궁금해서 가르쳐주실 분이 있을까 하여 물어봅니다..

1번은 blank를 잡으려던 d.w라 무시하셔도 되고, 2번이 첫번째 dna sample, 3번과 4번이 두번째 dna sample입니다. 1. ng/ul의 값은 순도인가요? 2. 첫번째 샘플과 두번째 샘플중 어느게 값이 잘나온건가요? 해석이 잘 안돼서요ㅠㅠ 두번째는 전기영동 결과인데요, 마커를 제외한 다섯칸에 모두 sample을 넣었는데 그중 두개는 나오지 않았습니다. 3. 샘플 두개가 안나온 이유가 뭘까요? 4. ladder에 구멍이 뚫렸는데 이유가 뭘까요? 5. sample들은 500bp가 나온게 맞나요?   귀한 시간 내주셔서 감사합니다. 너무 실험 초보라 구글링해도 기계만 다르다 하면 값을 계산하기가 어렵네요... 수준 낮은 질문이라 보이실수도 있지만 알려주시면 정말 감사하겠습니다ㅠㅠ

정말 이 분야에 문외한이라 질문이 부끄럽지만 늦은 나이에 직장을 그만두고 연구를 해보고싶어 대학원에 왔습니다. 선배들을 보면 우선은 어깨넘어로 배우라고는 하시는데 혼자 독학을 병행하고 싶어 질문드립니다. 1. 대학원 저년차때 R프로그램을 배워둘걸 후회한다는 선배들이 많은데 통계분석프로그램이라고만 알고있습니다. 어떤 부분에서 많이 쓰고들 계신가요? 2. RNA 시퀀싱..사실 이게 뭔지도 모릅니다. 다들 sing cell RNA 시퀀싱을 목표로 하시는것 같은데 물어봐도 bulk RNA 시퀀싱부터 갈길이 멀었다며 막연한 답변이구요ㅜㅜᆢ RNA시퀀싱등에 대한 기초개념을 익힐수 있는 참고서등이 있을까요? 3. 선배님들 보면 쥐 brain,heart 등을 이용해서 혈관의 gene이나 protein 등을 연구하는것 같습니다. 그런데 컴퓨터에는 마치 코딩?같은 작업을 병행하고 있구요 RNA시퀀싱등은 컴퓨터가 하는것인가요? 질문이 너무 초보적이라 죄송합니다.. 그냥 막연히 배우길 기다리기엔 제가 요즘 열정이 넘치는데 지식은 없어 가입했습니다.. 감사합니다

안녕하세요, 30분~1시간 정도 세포 (hepg2) 물질 처리를 해야하는데요… 제가 사용하려는 물질과 세포 배지 (저는 MEM을 씁니다)에 간섭 때문에 배지를 사용할 수 없는 상황입니다 ㅠㅠ 이럴경우… 1.dpbs를 30분 이상 처리해도 되나요? 2.dobs에 fbs를 첨가한다면 어떤가요? 혹시 비슷한 상황이셨던 분들의 조언을 구합니다 ㅠㅠ

green gate cloning 중인데 cloning이 처음입니다 mod c인 cds를 만들던 중 프라이머 Forward에 atg를 안붙이는 실수를 하여 처음부터 다시 프라이머를 짜서 처음부터 다시 짜서 pcr을 시행 하였습니다. 그런데 그전까지는 pcr이 잘 되었는데 atg를 붙이고 나서부터는 pcr이 되지 않습니다. template의 bp는 2370이고 cdna 사용 중입니다. 실수한 프라이머 forward는 AACA GGTCTC A GGCT GAGTCCTGCAATTGCATT  였고 tm은 60.2도 였고 새로 짠 primer forward는 AACA GGTCTC A GGCT ATGGAGTCCTGCAATTGC TM은 60.9도 입니다 리버스 프라이머는 AACA GGTCTC A CTGA CCCCCTCTTCTCTCTCC에  TM은 60.2도 입니다 pcr 조성 template    cdna          1μl primer(F+R 각 10pm)    1μl 5x HF Bfr                    2μl polymerase(phusion)     0.1μl dNTP                         1μl DW                           5μl 입니다 pcr condition은 98도씨    30s 98도씨     10s 60도씨     30s 72도씨     1m 15s cycle은 34번입니다. 실수한 프라이머에서는 PCR이 바로 나왔는데 ATG를 다니까 PCR을 계속 했는데 안나오고 T.M도 57~61도까지 0.5도씩 올려가며 다양하게 하였는데도 나오지 않았습니다. EXTENSION TIME을 1분 15초로 한 이유는 실수한 프라이머를 돌렸을 당시 저 시간대로 해서 나왔기 때문입니다. 그리고 밑에 사진에서 왼쪽에서 첫번째가 LADDER이고 두번째부터 5번째 까지가 59도씨에서 PCR6번째부터 마지막까지가 60도씨에서 PCR한 것 입니다. 같은 온도에서 왜 PCR를 여러개 한 이유는 저도 잘 모르겠습니다....... 계속 실수하다보니 멘탈이 터져서 그런거 같네요....

Multiplicity of infection (M.O.I) 개념은 이해가 가는데 더 자세히 알고싶어졌습니다.   M.O.I가 0.1이면 10개의 세포 중 1개 세포만 바이러스에 감염되는거고 M.O.I 0.01이면이면 100개의 세포 중 1개 세포만 바이러스에 감염된다는 건데   이것은 세포의 대략적인 수와 바이러스의 대략적인 수를 둘 다 알아야한다는 거잖아요. (분자와 분모가 얼마인지 알아야 0.1이든 0.01이든 나오는거니까....)   Agar 위에 바이러스를 뿌릴 때 양을 알고 있어야 한다는 건데 어떻게 알 수 있는건가요?   그리고 위에 뿌려진 바이러스가 100개 세포 중 1개만 감염시켰는지, 10개를 감염시켰는지 어떻게 확인할 수 있나요? 육안으로 보는건가요?   아직 실험을 직접 해본 적이 없어서....   도움부탁드립니다 ㅠ        

Taq DNA polymerase를 발현 및 정제하고 이를 이용하여 pcr과 전기영동을 진행하였습니다. 정제한 taq의 농도를 serial dilution하면서 총 5개의 샘플을 만들고 전기영동을 진행하였는데 가장 결과가 진하게 나와야할 1x에서는 아무런 결과가 나오지 않고 1/4x와 1/16x 샘플에서만 dna가 발현되었습니다. 아무리 오류의 원인을 생각해봐도 마땅한 이유를 찾지 못하여 질문을 올립니다. 혹시 원인이 무엇일까요? 사진 상에서 오른쪽 결과입니다. 참고로 왼쪽의 결과와는 taq polymerase를 제외한 나머지 화학품(primer, buffer 등)은 동일한 master mix를 사용하여 실험을 진행하였는데 왼쪽 결과는 제대로 나오고 오른쪽만 이상하게 나온 것이 의문입니다.

멜팅 커브는 뜨는데 ct값이나 amplification plot이 전혀 보이지 않아요    2x pcr master mix 10 ul  cdna sample (합성 후 10배희석) 2 ul  primer (R와 F를 1:10으로 희석한 후 master mix를 만들어서 사용) 1 ul  dw 7 ul  이렇게 했는데 결과가 몇 주째 나오지 않네요 ..