Vector , insert transformation. Colony 키워서 DNA prep 하기전에 Ecoli 를 gel run해보면 insert가있는것과 벡터만 있는것 사이즈 차이가 난다고 하는데요. Ecoli 얼마의 양을 몇도에서 boiling해서 Gel run하면 되는지요? 감사합니다.

안녕하세요. 현재 학부생입니다. 몇가지 질문이 있어 이렇게 질문은 남깁니다.   1. 20U/ul 제한효소를 1U/ul로 희석하려면 그냥 19ul buffer+1ul 제한효소 넣으면 1U/ul로 희석되는 게 맞나요?   2.프로메가 사 BamH1 제한효소 구경 중에 storage 버퍼가 있던데 이게 어디쓰는 건가요? 이걸로 효소를 희석하는 게 맞나요?   부탁드립니다.

안녕하세요 석사 학위과정 중인 학생입니다. 최근 cloning을 한 후 cloning이 잘 되었는지 사이즈 컨펌 colony PCR을 하는데 사진과 같이 DNA가 comb에 걸려 내려오지 않습니다.  colony PCR 시, colony를 아주 소량 따서 PCR 하였으며 annealing Tm과 extension time 모두 적절하게 하였습니다.  colony PCR이 되지 않아 LB broth에 접종하여 16h culture 후 LB O/N cell 200ul cell down하여 PBS 200ul으로 washing 후 DW 20ul으로 suspension 후 95도 5분 boiling한 sample을 template로 동일한 조건으로 PCR을 하여도 comb에 DNA가 걸립니다. 전기영동은 1% agarose에서 하였습니다.   1. comb에 PCR product가 걸린 것은 PCR product인가요? 아니면 colony로 넣은 template가 걸린것 인가요?   2. 이 경우 size confirm하기 위해 plasmid를 prep 후 plasmid를 template로 하거나 enzyme cut하여 cloning 여부를 확인할 수 있나요?      

안녕하세요 primer를 처음 짜봐서 일단 연습 겸 한 번 짜봤는데 괜찮은지 봐주세요 ..  subcloning할 예정입니다. cloning용 vector에 target gene이 삽입되어 있는 상태이구요. primer를 제작해 pcr을 통해 insert를 증폭시킨 후 expression용 vector와 cloning할 계획입니다.    제한 효소는 NdeⅠ, HindⅢ 입니다. foward primer 5'-CGCTCT(meaningless)CATATG(NdeⅠ)GCCACC(kozac)ATGCTGACCTTTCATCGCAT(gene)-3' reverse primer 5'-CGCTCT(meaningless)AAGCTT(HindⅢ)TCGGCCACGCCAC(gene)-3'  

안녕하세요 아직 아무것도 모르는 대학원생입니다 ㅠㅠ target gene을 삽입시킨 cloning용 vector를 주문했습니다.  pcr을 통해서 insert를 증폭시키는 과정을하기 위해 primer 제작 과정중에 있습니다. 얻은 insert를 expression 용 vector에 cloning하는게 목표인데요. expression용 vector에서 쓰이는 제한효소는 NdeⅠ이랑 HindⅢ입니다.  하지만 cloning용 vector에는 그 두개의 제한효소를 가지고 있지 않습니다.      이럴 땐 어떻게 해야 하나요?  

cloning실험중인 학생입니다.  항상 mini prep을 하면 dna 흡광도가 0.1 수준으로 30마이크로리터 정도 얻고있습니다.  증류수와 VECTOR DNA 2μl씩 SPECTROMETER에 떨어뜨리고 측정하면 DNA 흡광도가 0.1~0.2정도입니다.  이제 dna 양을 계산해보면 대략 0.1x50해서 5μg/ml가 나옵니다. miniprep 할때 elution은 증류수로 30 μl 떨어뜨렸습니다.  근데 현재 사용하는 제한효소는 Nde1과 Hind3인데 홈페이지를 보면 1μg이 적정량이라고 나와있어서 VECTOR DNA를 얼마나 사용해야할까요,,  제한효소 처리를 하면 밴드가 안보여서  농도를 높여야겠는건 알겠는데 MINI PREP을 하면 DNA양이 너무 적어서 고민입니다.,,  질문: 어떻게 하면 10μL 안의 DNA 양을 1 μg 까지 늘릴수있을까요?????? 프로토콜은 이렇습니다 Vector DNA : 1 μg ( ≈ to 10 μL)  그동안 밴드가 안보였던 이유가 DNA양이 기준보다 적어서였던것같습니다.  10X NEBuffer 2.1 : 2 μL Nde I : 1 μL (20 units) Hind III : 1 μL (20 units) D.W :  to 20 μL // Total 20 μL Temperature : 37 ℃, Time : 1 hr ~ 2 hr  

오늘 사수님께 여쭤 보았는데 그러면  single colony를 picking 하는 이유가 없지 않냐고 하셔서 질문드립니당   single colony를 picking을 하는 이유가  genetic background를 같게 하기 위해서라고 알고 있어서요!   우리가 transformation 시킨 plasmid를 prep 한다고 하면 gDNA 등은 Sol2 때 fragmentation 되어지니  실질적으로 plasmid만 얻는 것이기에 genetic background가 의미 없지 않은가라는 생각이 들더라고요. 사실상 doubling time을 한 번 더하게 하는 것이므로 30분 정도 배양을 더 하는 효과를 가져오는게 아닌가라는 생각이 들어 질문 드려봅니당

 제가 이번에 처음으로 lentiCRISPR v2 Vector를 이용하여 konck down 실험을  해보려고 하는데 처음이다 보니 너무 미숙한 것이 많아 조언을 얻고자 합니다. 우선 gRNA design은 어떻게 해야 하는지 protocol을 다 숙지하고 gRNA design tool을 이용하려고 하는데 처음으로 사이트를 이용하다 보니 도대체 뭐가 뭔지 이해가 되지 않아 글을 씁니다.  우선 genScript tool 사이트를 들어가보니 시퀀스 이름 / 표적 게놈 / 순서를 입력하라는데 순서가 target sequence 게놈이 target cell 이 맞는지 궁금합니다.   그리고 시퀀스 이름은 도대체 뭘 적으라고 하는지 모르겠습닌다...

안녕하세요 석사 입학생입니다. golden gate assembly를 진행하려고 하는데 실험실에 해보신분들이 없어서 여기에다가 질문드립니다. 외부 plasmid에 들어있는 유전자 부분을 가져와 golden gate assembly에 사용하고 싶은데요. 외부 유전자를 우선 따고 싶은 부분에 bsal 서열을 넣어 pcr진행하여 얻은 다음 바로 golden gate assembly pcr를 진행하는건지, dpn1 처리 후 pcr purification 진행 후. assembly를 시작하는건지 여쭤봐도 괜찮을 까여?

csTyr-N를 pcr후 밴드 확인하고 잘라서 gel extraction을 하고 제한효소 HindIII 랑NDE1 로 37도 워터배스에서 중간에 온도가 35도까지 내려가긴했었는데 37도로 다시 올려서 30분반응시켜서 총 2시간 반응시키고 전기영동후 확인해보았는데 밴드가 너무 희미하게보여서 어디서 부터 잘못된건지,,, gel extraction 단계부터 오류가 있을것같은데 무엇이 문제일까요.. 피펫팅은 당연히 했습니다..

안녕하세요. 클로닝만 한달째인데 확인단계에서 계속 막히고 있어서 질문드립니다.   콜로니 자체는 여러개 뜹니다. 옆에 새틀들이 좀 많긴 했지만 transformation time이 조금 길어서 그런가 싶구요. 총 3개의 클로닝도 같이 동시에 진행중인데 모두 콜로니는 뜨지만 동일한 벡터를 사용해 하나의 vector specific primer를 이용해 colony PCR을 하면 전부 원하는 밴드가 뜨지 않습니다.   그 중 한 종류의 클로닝만 insert에서 잡는 150bp 정도의 primer가 있어서 그걸로 colony PCR을 했고, 6개 콜로니 전부 맞는 밴드가 나와서 mini prep을 진행했습니다.  vector 5000bp, insert 3000bp여서 colony PCR이 안나왔나 하지만 다른 클로닝의 경우 700-800bp정도인데도 vector specific primer로 나오지 않았습니다.   아무튼 밴드 나와서 mini prep한 플라스미드를 이용해 클로닝할 때 동일한 RE로 cut을 하고 cut과 un cut을 같이 gel에 내렸습니다. 그 중 하나의 colony에서 mini prep한 plasmid에서만 un cut에서 one band가 나왔고, 맞는 실험결과라면 cut에서 5000bp와 3000bp 투 밴드가 나와야할텐데 5000bp에서 원밴드만 떳습니다.   Asc1과 SgrA1 이렇게 double Restriction enzyme을 사용하였고, 벡터만 self ligation test를 해봤을 때 아무런 콜로니도 뜨지 않았습니다.. 애초에 백터도 digestion한 후 잘린 맞는 size의 밴드만 gel extraction하였구요.  만약 insert가 안들어간것이라면 왜 colony PCR에서 맞는 사이즈의 밴드가 떴을까요... (construct내에서 primer가 잡는 다른 site는 없습니다.) 근데 colony PCR 후 밴드가 뜬 다른 colony에서 mini prep 후 restriction cut 했을 때 총 4개를 내렸는데, 하나빼고 non-cut 자체도 gel에 안내려오는 것도 이상합니다. (LB에서 자라기는 합니다. 단 mini prep 했을 때 농도가 낮긴했어요)    뭐가 문제일까요 일단 시퀸싱을 맡겨봐야할까요 아시는 분 있으시면 도움주시면 감사하겠습니다. 

cloning 처음해보는 초보입니다 ㅠㅠ 고수님들의 조언 부탁드립니다. 이번에 restriction enzyme을 이용한 cloning을 하기위해 primer를 제작하게 됐습니다. 제한효소로 BamHI 과 XhoI을 선택하였고, vector에 넣어줄 DNA의 양 끝에 BamHI과 XhoI 인식하는 부분을 붙인 primer를 제작하고자 합니다. 그런데 DNA 말단에 제한효소가 인식하는 부분을 붙일 때 BamHI같은 경우에는 이와같이 인식부위 옆에 특정 서열을 더 붙여줘야 cleavage%가 늘어난다고 나와있어서  CGGGATCCCG 를 primer 앞에 추가로 붙여주었습니다.  제 궁금증은 예를들어 이런식으로 26mer의 primer를 만들게 되면 primer 전체의 GC%는 54%이지만, target DNA seq에 annealed되는 primer의 GC%는 33%밖에 나오지 않았습니다. 1. 그렇다면 GC%는 전체 primer 로 계산하는 것이 맞는지 or 처음 DNA에 annealed 되는 GC%부분을 계산하는 것이 맞는지, 아니면 둘 다 적절한 GC%를 가진 primer를 제작해야 하는것인지(이경우에는 primer 길이가 너무 길어집니다)궁금합니다. 2. 전체 primer는 26mer이지만 제한효소 인식부위를 제외한 primer 길이는 15mer 밖에 되지 않은데 이게 seq를 specific하게 인식하여 결합이 잘 될지?(pcr효율이 잘 나올지) 궁급합니다. 

석사과정 대학원생입니다. E. coli ->Bacillus에 클로닝 했고, 해당 inset vector를 유산균에 electroporation하고 있는데, 몇달 째 애를 먹고 있습니다. 실험조건에 대해 점검 혹은 개선할 점을 여쭙고 싶습니다. 1) 균주: L. lactics MG1363 - OD600값: 0.5~0.8, wasing 1~3번까지 각각 실험 2) Washing 용액: 3가지 종류로 각각 실험 0.5M sucrose (or) 0.5M sucrose+ 10% glycerol (or) 10% glycerol 3) 배지: MRS + antibiotic maker -> 30℃ incubator 4) com cell 100ul 씩 분주하여 deep freezer 5) com cell 100ul + vector DNA 1~2ul(600ng/ml) 6) 0.2cm 큐벳사용  - 1.5kv (or) 1.8kv (or) 2.0kv (or) 2.5kv 각각 실험   com cell효율 높이려고 많이 노력하고 있는데 Bacillus에는 클로닝이 되는데유산균은 죽어도 안되는 것이...어떤 부분이 문제인지 보이신다면 조언 부탁드립니다.  

vector 와 insert에 enzyme cut 진행 후 ligation을 진행할려고 하는데요 2개의 enzyme를 사용하다 보니 gel 상에서 band가 2개가 나오긴 하는데 이걸 제가 원하는 size부분을 gel extraction으로 자르고 ligation을 진행하는 걸까요? 아님 그냥 진행하는 걸까요?

람다파지를 이용한 유전자클로닝부분 공부하고있는데요 cos서열이 람다파지 genome의 circular form 형성에 관여한다는건 알고있는데  스샷 설명글을 보면 'cos 자리가 손상된 람다 DNA를 숙주에서 증식하여~'라는 부분이 있습니다. cos자리가 왜 손상되어야 하는지 궁금합니다. 의미가 와닿지가 않아서요....

TA cloning한 plate에서 30개의 colony를 골라 5개씩 묶어 colony PCR하였습니다. 일단 30개를 mini prep을 위해 culture를 시작하긴 하였는데,  첨부파일 같은 결과를 얻었습니다. 혹시 6개 section 모두 되었다고 봐도 될까요? QPCR inner primer로 PCR했을때는 5,6번에서 vector size 정도의 band가 나오고 있어서 이게 된건가 싶기도 합니다. 고수님들의 의견을 부탁드립니다.