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BioLab 박소정 교수
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 카테고리: 전체 > Immunology > Immunocytochemistry
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질문/투표/프로토콜 등록
Q. LDH assay sample을 얼렸다가 해동하면 안되나요?
안녕하세요. 실험을 하고 있는 학부생입니다. 약 2-3달전 LDH assay를 한 media sample을 얼려두었는데 다시 사용하기 앞서 재측정을 했는데 전과 전혀 다른 결과(각 군과의 수치의 변화가 없음)가 나옵니다. LDH양의 변화는 없을것으로 생각되어 이번 결과에 대한 의구심이 생깁니다. 혹시 저와 같은 경험이 있으시거나 이번 결과에 대한 설명 가능하신분 있으시면 대답해주시면 감사하겠습니다. ㅠㅠ 도와주세요. 감사합니다. 추측1) 첫 측정한 LDH assay의 결과가 잘못된 것이다. 2) 두 번째 측정을 잘못했다. 3) 얼렸다가 해동하여 재측정하면 원래 잘 안나온다. 등등..
회원작성글 오비쿤  |  2021.03.03
Q. IHC 의미 질문
안녕하세요. 이번에 IHC를 진행하려고 하는데 제가 찾아본 봐로는 IHC는 tissue에 적용되는 거고, cultured cell에서는 IF또는 ICC를 해야된다고 합니다. 이부분에서 교수님께서 IHC 준비하라고 하시는 부분은 ICC를 진행한다고 하시는 거겠죠?   준비하는 과정에서 쟤가 antibody를  primary antibody를 cell signaling b-acin(#4967), secondary antibody는 Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab6802) 사용하려고 하는데 substrate는 vector laboratories의 DAB Substrate Kit, Peroxidase (HRP), with Nickel로 사용하려고 하는데 맞는 걸까요? 답변 주시면 감사하겠습니다. 
회원작성글 rovmemi  |  2021.01.26
Q. Phagocytosis assay 관련 질문 입니다
제가 FACS 랑 암을 안해봐서 그런데 tumor cell (in vitro) 키워서 drug 처리 한 다음에 FACS로 phagocytosis 관찰 가능한가요?? PBMC 에서 분리해서 co-culture 해야 되려나요??
회원작성글 안녕하시요  |  2021.01.07
Q. ICC에서 FITC 결과가 안나와요 첨부파일
안녕하세요 3개월차 예비 대학원생입니다.   최근에 ICC를 배워 혼자 진행해보았는데요, DAPI는 잘 나오지만 FITC에서 염색이 잘 안됩니다. 밑에는 진행한 실험의 과정입니다.     <실험과정> 1. 4x6well에 5x10^4 cell  2. overnight 3. PFA로 고정 후 20분 이상 4℃ 4. PBS(tritonX100포함) washing 5. blocking 20분 -blocking buffer : FBS 1%+TritonX100 0.1%+PBS 20ml까지 6. 1차 antibody overnight 7. 2차 antibody 1시간 8. washing 9. DAPI 10. 말리고 현미경   어느 과정에서 잘못된건지 궁금합니다.  사용한 antibody는 abcam의 F4 사용하였습니다.   감사합니다.
회원작성글 신짜오  |  2020.12.08
Q. paraffin block을 이용하여 ihc해도 dendrite가 안보여요ㅠㅠ
안녕하세요 mouse의 cerebellum을 paraffin block으로 만들어서 section 후, ihc을 하려고합니다 조직을 4마이크로의 두께로 section하여 ihc을 해 보았을 때 뉴런의 dendrite가 잘 보이지 않습니다 조직을 너무 얇게 잘라서 dendrite가 다 잘려나간건가 싶어 더 두껍게 잘라보려고하는데 어느정도의 두께가 적당한지 몰라 질문합니다ㅠㅠ frozen block의 경우 40마이크로 정도로 섹션하여 확인하는 것 같은데 파라핀 블럭의 경우 40마이크로로 섹션하면 잘라지면서 파라핀이 다 갈라질 것 같은데 어느정도로 하는게 적당할까요,,? 프로토콜을 확인해보니 5~8정도의 두께로 섹션하라고 되어있긴하던데ㅠㅠ
회원작성글 복돌이뿡뿡  |  2020.12.04
Q. ICC과정중에 fix후 -20도나 -80도에 보관 하시는 분 계시나요?
선배님들 안녕하세요 다름이 아니라 제목대로 ICC 과정중 fix후 다음 step진행전에  -20,-80에 보관이 가능한지 알고싶습니다 ㅎㅎ 감사합니다
회원작성글 Mintsun  |  2020.10.14
Q. 추출물 전처리에 대한 질문이 있습니다.
안녕하세요 항염증논문을 읽고 궁금증이 생긴 대학교3학년 학생입니다. 염증 반응에 대해 논문을 읽었을때 생긴 궁금증입니다. LPS 처리를 하기 전 추출물 전처리를 1h 동안 진행 후 30min LPS 처리를 한 후 모든 실험을 진행을 하는걸 읽었는데 이 부분에서 궁금증이 생겼습니다. LPS 처리를 하고 추출물 처리를 하면 되지 않나? 라는 생각이 들었는데 굳이 추출물 전처리를 한 후 LPS를 처리를 하는 이유가 있는건가요?
회원작성글 EWSN  |  2020.10.10
Q. 사이토카인 관련 질문드립니다
논문을 보다가 제가 이해한게 정확한지 궁금합니다. 외부에서 유해한 자극이 가해지면 세포가 손상되어 염증반응을 유도하기 위해 여러 면역세포에서 사이토카인이라는 단백질 면역조절제가 분비되는데, 사이토카인 중에 인터류킨이 있고, PCR을 통해 IL-6 mRNA 발현량을 관찰했을 때 발현량이 많으면 염증반응이 많이 일어났다는 것인가요? 
회원작성글 ksj32307  |  2020.09.18
Q. 4% PFA가 permeablization에 영향을 주나요?
GPCR 을 염색을 하기 위해 실험 중입니다.  receptor specific binding 형광 표지 물질을 사용하고요  (antibody x)  과정은  세포 배지를 제거하고 PBS Washing한 뒤  4% paraformaldehye를 10분동안 RT에 Incubation하고 형광 물질 처리 후 따로 permeablization과정을 하지 않고 물질처리 후 confocal로 관찰합니다.  그런데, 세포질에 염색이 안되고 핵에 염색 되더라구요 (dapi와 겹침)  그래서 living cell에다가 해봤는데 이번엔 세포질에 잘 염색이 되더라고요  핵 부분에는 뻥 뚤린채로요  4% PFA가 문제였던 것 같은데  아무래도 세포가 좀 쪼그라드는 것 같아서 고정을 해야할 것 같은데  농도를 낮추면 permeablization이 덜 할 까요?  4% PFA가 Permablization에 영향이 그렇게 있는건가요? ㅜ
회원작성글 sidsidsid  |  2020.08.27
Q. FACS 사용관련하여 문의
안녕하세요. FACS 장비 사용관련하여 문의드립니다. 대부분 실험실에 FACS 장비가 있나요? 장비가 없는 실험실은 교내 공실관이나 주변에 있는 연구소, 테크노파크 등에 있는 장비를 활용하고 있다고 들었는데.. 많이들 사용 하시나요? 외부에서 FACS측정할때 주의할 점?  세포 염색 후 최대 몇시간까지 측정이 가능한가요?   답변부탁드립니다.
회원작성글 membrane  |  2020.08.05
Q. NO assay 에서 positive control로 쓰는 dexametahsone의 IC50?
자꾸 NO assay가 해결이 안되서 비슷한 질문을 또 올리게 되네요 ㅠ  문헌에서보니 RAW264.7 cell에서의 Dexamethasone 의 IC 50가 5uM 이하인듯 한데요...  실험 해본 결과 IC50가 1mM 정도 나오는건  문제가 있는거겠죠....?
회원작성글 soi  |  2020.06.15
Q. NO assay 저해제가 작동하지 않아요 ㅠㅠ
bioactive 펩타이드로 NO assay 를 하고 있습니다.  실험조건은  96well에 10만개, RAW264.7, LPS 1ug/mL, 샘플-LPS 동시 처리후 24시간 배양하였고, 사용된 배지는 phenol red 포함한 DMEM입니다. 결과를 말씀드리면,control에 비해  LPS를 넣은 경우 NO 생성이 5-8배 증가하였습니다. 문제는 처리한 펩타이드 (~500ug/mL)의 NO 저해가 전혀 효과가 없었습니다.  Q1. phenol red가   griess시약의 발색과 유사하여 phenol red없는 배지를 써야 한다는 말이 많던데, 생각해 보면  LPS를 처리하지 않은 control에도 phenol red가 들어가기 때문에 굳이 phenol red가 안들어간 배지를 사용해야 할까요? Q2. 문헌에서 10ug/mL에서 항염 효능이 있다고 되어 있는 펩타이드인데도 500ug/mL 에서조차 전혀 저해능이 없었습니다. 뭐가 문제일까요?  LPS에 의해 RAW cell이 activation되어 끄덕도 없는걸까요.. 이 펩타이드를 positive control로 생각하고 진행한건데,, 전혀 효능이 보이지 않아 당황스럽습니다. 혹시 positive control로 사용하는 항염 펩타이드가 있다면 추천 부탁드립니다.    
회원작성글 soi  |  2020.06.01
Q. NO assay 프로토콜에 따라 같은 물질이어도 차이가 많이 날수 있을까요?
직접 NO assay를 해본 적은 없고 다른 연구소와 cowork으로 항염 활성을 평가하고 있습니다.  그런데 첫번째 연구소과 두번째 연구소에서의 활성이 많이 다릅니다. 비교해 보면 정말 큰 차이는 없는데,,,,제가 프로토콜을 분석해본 결과 다음과 같은 차이가 있습니다. 물론 다른 cell 상태, LPS 상태도 다를 것이라 생각됩니다.   1. 96well에 6만개 RAW264.7cell, LPS 100ng/mL   -NO 생성 저해능100ug/mL에서 65%    2. 96well에 10만개 RAW264.7cell, LPS 1ug/mL  -NO 생성 저해능100ug/mL에서 20%  입니다. 상당한 차이가 있는데요..   혹시 LPS가 10배 차이가 나는데, LPS 대비 샘플의 농도가 낮아서 효능이 낮게 나올수도 있을까요?   그리고 phenol red있는 DMEM을 사용하는 경우, griess assay에 크게 영향을 미치나요? control, +LPS, +LPS+ 샘플 모두 같은 조건이니 괜찮지 않을까요?  
회원작성글 soi  |  2020.04.01
Q. IHC 시 오래된 파라핀 블록으로 슬라이드 만들어도 무관한지요.
기존에 H&E 염색 하려고 만든 파라핀 블록이 있는데, 며칠 안된 것부터 2년 된 것까지 있습니다.   지금 3번정도 약 1-2년된 파라핀 블록을 다시 절삭해서 IHC를 하였는데, positive control임에도 불구하고 negetive로 나옵니다.   Antigen retrieval 이 안된건가 생각해봐서 primary antibody 농도를 좀 올려서 했는데도 negative로 나오고..     1. 오래된 블록이라서 그런 가능성도 있나요? 2. 한번에 슬라이드를 많이 깎아놓고 4도씨 보관했다가 꺼내서 신전기에 올려두었다가 진행할 때도 있는데, 신전기에 12시간 이상 두었다가 실험하는 것도 영향을 미칠까요?   제가 IHC가 메인인 업무가 아닌데다 주변에 IHC를 하는 사람이 거의 없어서 positive control에서 조차 이런 결과는 당황스럽습니다ㅠ
회원작성글 도롱갓  |  2020.01.07
Q. ICC진행중인데 컨트롤에서 계속 형광이 나타납니다.
안녕하세요 브릭에서 많은걸 질문하고 얻어가고 있는 석사1년차입니다.   최근 단백질 처리후 투과를 보기위해 ICC를 진행하고있습니다.  진행하는 방법은 1. cell Fixation 2. 0.25% Triton X-100 (in PBS)으로 30분 3. PBS or PBS-T로 5회 washing 4. 3% BSA sol. (in PBS-T)로 blocking 1시간 5. 3과 동일하게 washing 6. 1% BSA sol. (in PBS-T)에 1st Ab (250:1) 첨가. 4℃에서 O/N 7. 다음날 3과 동일하게 washing 8. 1% BSA sol. (in PBS-T)에 2nd Ab(Alexa488)(500:1) 첨가. 암실, RT에서 반응 1시간 9. 3과 동일하게 washing 10. DAPI (in PBS) 1000:1(혹은 2000:1까지 희석가능) 이용해 암실에서 1분(넘기지 않게) 반응 11. washing 3회   진행하고 있습니다. 제가 사용하는 단백질은 T7tag와  6x histidine이 달려있어서 먼저 t7으로 진행했는데 컨트롤에서도 거의 유사하게 형광이 잡혀서 이번에는 histidine으로도 진행해봤으나 역시 컨트롤에서도 나와 매우 곤란한 상황입니다. 단백질에 대한 항체는 아직 보유하고 있지않은데 원래 이게 일반적인 세포에서도 나오는거라 구매를해서 진행해도 같은결과가 나올까 주문을 고민하고 있습니다. cell은 HDF로 진행하고 있습니다... 혹시 뭐가 잘못된걸까요...?확인은 형광형미경으로 진행하엿습니다..
회원작성글 시은  |  2019.11.18
Q. 조직에서부터 전반적인 면역세포를 타켓으로 볼수 있는 염색법이 있을까요?
조직에서 부터 면역세포를 확인 하고자 하려고 합니다.   근데 조직 슬라이드가 한정이 되어있어서 세포마다 targeting 하여 IHC로 보기가 어려 울거 같습니다.   전반적으로 면역세포만 염색하는 방법이 있는지요?
회원작성글 m881119  |  2019.09.18
Q. 항염증과 항산화, 항암은 다 서로 관계가 있나요?
항염증 연구와 관련된 논문들을 살펴보다 보니 많은 식물들이 항염증 효과와 항산화를 둘 다 갖고 있고, 심지어는 항암 효과도 가지고 있는 경우가 많더라구요 개념을 찾아봐도 많이 헷갈려요.. 항산화와 항염증, 항암은 어떤 관계가 있는 건가요? 항염증이 있으면 무조건 항산화 효능, 항암효능이 있다고 봐도 되는 건가요?
회원작성글 ㅈㄱㅈㄱ  |  2019.08.10
Q. ihc/icc negative control human IgG
제가 지금 breast cancer tissue와 breast cancer cell에 human igg를 negative control로 사용하고 있습니다. human igg가 facs(ihc와 동일한 antibody사용)에서는 binding 하지않는데 ihc에서는 binding이 너무 잘됩니다. 제 이론상으로는 아예 염색이 하나도 되지 않아야 하는데 이유가 무엇일까요? 제가 논문을 좀 찾아본 결과로 paraffin block을 만들면 조직이 소수성이 높아져 igg의 fc부분을 비특이적으로 결합을 시킨다고 알려져 있습니다. 이게 문제인건가요? 현재 개발하고 있는 antibody가 정확하게 붙었는지 확인 할려면 negative가 필요할 것 같은데 다른걸 써야하나요? 개발하고 있는 antibody가 mouse에서 생성한 antibody인데 그럼 ihc 할 때 mouse igg를 사용해서 비교해야하나요?
회원작성글 moltox  |  2019.06.28
Q. ICC시, 1차 항체 2개
안녕하세요. ICC 처음 진행하게 돼서 그와 관련하여 여쭤볼게 있습니다.   약물의 시간별 처리에 따라 Mitochondria에서의 2가지 항체가 co-하는지 확인하고자 하는데요.   Q1. Blocking 후에 1차항체 A (Host M) 와 1차항체 B (Host R)를 처리할 때,    1) 1차항체 A 넣고, RT 1hr and washing 후 B넣고 RT 1hr and washing        또는    2) A와 B를 같이 넣은 후, 4도 O/N 후 washing       어떤 방식으로 하는게 좋을지요?   Q2. 2차항체도 A와 B에 대해서 시간을 두고 넣어야할까요, 아니면 동시에       넣고 진행해도 상관없을까요?   Q3. 위의 1차와 2차 항체 붙이는 과정 끝난 후에 mito-tracker로 최종 염색         하면 될까요?   답변해주시면 고맙겠습니다 :)  
회원작성글 John_yun  |  2019.06.11
Q. IHC에서 antigen retrival시 Citrate buffer 재사용 하여도 되나요?
IHC할때 Antigen retrival 시에 95"로 끓이잖아요   이때 전에 한번 끓인 citrate buffer 재사용 가능한가요?
회원작성글 앙재문  |  2019.04.04
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