HEK-293T을 liposome을 이용하여 transfection 했습니다. transfection 효율이 절반 정도입니다. lipofectamine 2000 사용 중인데, HEK-293T 경우 효율이 90% 이상이라고 하여 질문드립니다. HEK-293T lipofection 시에 효율을 높이고 싶은데 어떻게 하는 것이 좋을까요?

1) BglII-Gene1-Linker A 2) Linker A-Gene2-KpnI-LinkerB 3) LinkerB complementary sequence   1과 2를 연결하려고 합니다 교수님께서는 2에서 Linker B의 complementry sequence를 붙이고 KpnI으로 나중에 cut하자고 하셨는데   1. 1과 2를 연결하는 overlap PCR method에 대해서 문의드리고 싶습니다 2. 그리고 3번의 complementary sequence를 활용하는 방법도 문의드리고 싶습니다   PCR 초보라서 이것저것 여쭤봅니다 ㅎㅎ;;;

Tumor post analysis                            at 4 hrs post-dose, PD marker pRET Y1062 pSHCY239/Y240 Total RET Total SRC     이실험이 먼지 아시는분 혹시 있을까요?

안녕하세요, 석사과정 반년차 대학원생입니다. 실험 중 세포 control 과정에서 생기는 cell loss와 관련하여 질문이 있어 글을 남기게 되었습니다..ㅜㅜ   현재 5-70% 정도의 세포사멸을 유도한 cell을 AnnexinV-Kit와 TUNEL-kit로 각각 staining하여 facs로 분석하는 실험을 진행하고 있습니다.   그런데 같은 양의 세포를 컨트롤 하더라도 Protocol step이 보다 간결한 Annexin 실험의 경우 staining후 facs로 분석하기에 충분한 양의 세포가 남는 것에 반해, TUNEL의 경우 Cell fixation (wash 과정 포함) + Cell staining (wash 과정 포함) 두 과정으로 나뉘고, Annexin에 비해 wash step도 더 많아서인지 cell loss가 많이 발생하고 있어서 고민입니다.    wash하고 centrifuge 돌리는 step이 많아서 그런 것 같은데, 이 부분을 극복하기 위해 상층액을 제거 할 때도 석션기를 안쓰고 파이펫으로 살살 떠냈거든요. 그럼에도 남는 cell이 많지 않아 고민입니다.  (처음부터 세포를 burk로 키우고 drug을 처리하여 많은 양의 세포를 핸들링하는 방법도 있겠지만, kit protocol이 명시하고 있는 세포 농도가 정해져 있고, kit assay 횟수도 이에 맞춰져 있어 이 부분은 고려하기 어려운 상황입니다.) 그렇다고 wash step을 줄이거나 대충하고 넘기기엔 staining(효소반응 등)이 제대로 이루어지지 않을 까봐 염려가 되어서요.. 현재 생각해둔 해결 방안으로는 g-force를 높여서 최대한 많은 양의 세포가 모일 수 있도록 유도하려고 하는 것인데요, 세포 종류는 Jurkat cell이고, cell maintain 할 땐 150g x 5 min으로 centri하고 있습니다. TUNEL kit 상 안내된 g-force가 300g x 5 min이어서 이전 실험에서는 이렇게 진행하였구요. 해당 세포나 관련 실험에서 cell loss를 줄이기 위해 어떠한 방법들을 고려하셨는지, 선배님들의 조언을 구하고자 합니다.   그럼 다들 하시는 실험 모두 잘 되시길 바라며, 답변 주시면 감사드리겠습니다 : )      

원래 4도씨에서 한시간으로 붙이는데 다릉 분들 보면 오버나잇으로 하는분들도 있고 상온에서 2시간 하시는분들도 계신데 4도씨 1시간은 너무 짧은가요? 4도씨에서 하면 항체가 붙는게 좀 느려지는건가요 아니면 단순히 항체에 온도가 높아지면 안좋아서 그런건가요

안녕하세요  엔도톡신 시험 중 벽을 만나 문의드립니다.   천연물 추출물을 희석해서 용액을 만들었을 때는 엔도톡신 정량이 잘되었으나 3개월 후 소분하여 보관된 샘플로 recovery가 낮게 나옵니다. 혹시 원인이 따로 있을까요 시험시에 10배, 20배 희석화여 진행하였습니다. 세균은 검출되지 않았습니다.   갑자기 3개월 만에 시험이 안되는 이유가 있을까요.  

안녕하세요. 저는 반도체 분야 바이오센서에 대해 연구중에 있습니다.  항원과 항체에 따른 반응 차이를 확인하는 실험중입니다. 하지만 완전 초보라 찾아보면서 공부하긴했는데 많은 부분이 생략되어 어려움을 겪고 있습니다.  (ELISA Sandwich 실험중입니다.)   1. BSA만 코팅되어 측정  - 여기서 BSA와 무엇을 섞어 사용해야하는지? (DI water, DPBS 보유중) - 코팅하는 방법이 무엇인지? (glass 위에 코팅하려고 합니다)   2. 항체 IgG만 코팅되어 측정 - glass 위에 올려 4도 overnight 했습니다. 이때 Blocking과 Washing을 하라고 나와있는데 어떻게 하는지? (blocking buffer 보유중)   3. 항체 IgG와 BSA가 같이 코팅되어 측정 - 이렇게 두개를 코팅하고 싶은데 실험 순서를 어떻게 해야하는지?   한달동안 검색하고 찾아보고해도 제대로 된 답이 안나오네요... 도움 주시면 정말 감사하겠습니다. 

안녕하세요.. 대학원생입니다. 제가 보통 thermo 사의 onestep 장비를 이용하여 qPCR을 돌리는데, 예약관계로 CFX96으로 같은 세팅으로 돌렸는데 amplification 값이 나오지 않아 질문드립니다. melting curve는 잘 나오는데 amplification 값이 모두 N/A가 나와 분석이 불가능 한 상황입니다... 그냥 Ct값만 나오면 계산하려고 house keeping gene등 모두 unkonown 으로 두고 qPCR을 돌렸는데 값이 나오지 않네요,,ㅠㅠ  결과랑 melting curve 등,,,아래 첨부드립니다. 도움,,부탁드리겠습니다. 감사합니다. 

cell density : 1 x 106 cells/ml  total cells : 1 x 106 cells x suspension media 5 ml = 5 x 106 cells   여기서 제가 필요한 cell density는 4 x 105 cells/ml 즉, (1 x 106 cell/ml)/(4 x 105 cells/ml) = 0.25 ml의 cell을 e-tube에 넣은 후  spin down 하게 되면 4 x 105의 cell pellet을 만들 수 있는가요?    suspension media는 고려 사항이 아닌가요?   

안녕하세요? 오늘 1%~4% NaCl이 첨가 된 Mueller-Hinton Broth를 제조 하였는데요, 다만 4%의 배지에서 결정이 생기던데 혹시 이러는 이유가 따로 있는건가요? 아니면 단순히 이물질이 첨가 되었던 걸까요??

OCT tissue 분석을 마이크로톱으로 잘라서 관찰을 하려고 보니   다른 tissue들은 PBS로 2~3회 세척후 보면 주위에 남아 있던 OCT들이 제대로  새척이 되었지만 fat tiusse들은 세척 후에도 OCT랑 버블들이 남아 있습니다. 이걸 제거 할 수 있는 방법이 있을까요?    

안녕하세요. 현재 웨스턴블랏으로 고생하고 있는 대학원생입니다 웨스턴 블랏을 처음 해보는거라서 고생좀 많이 했는데 이제 밴드가 나오긴 해도 너무 얇게 나오네요… 사진에서 왼쪽부터 3개는 20ug, 4번째는 30, 5번째 40, 6-7번째는 20ug 단백질을 넣는겁니다 단백질 양이 많진않아서 30,40을 제외하곤 loading volume을 25uL로 맞춰서 5X sample buffer 5uL 나머지 sample protein과 DW로 넣었고요 오늘 내려보니까 30과 40을 넣은 well은 전기영동때부터 끌리면서 내려오더라고요 이쁘게 끌린것도 아니고 그냥 뒤죽박죽으로 끌려내려왔어요 밴드를 찍어봐도 4,5번째는 밴드가 다른거에 비해 두껍지도 않네요 근데 그건 제 생각엔 단백질 양에비해 sample buffer가 적었을 가능성을 생각하고 있긴합니다 아마 well쪽에서 걸려서 나머지가 못내려온건지… 아무튼 그것도 문제지만 더 문제는 저 밴드들이 너무 얇다는 것입니다 다른 논문들 보면 밴드가 적당히 두껍게 다 이쁘게 나오는데 저는 뭐 둘이 비교하지도 못할꺼같네요… 단백질양이 부족한걸까요? 우선 제가 하고 있는 protocol을 간략히 써드리겠습니다 SDS PAGE 150V 1시간30분 Transfer 350mA 1시간20분 5% skim milk TBST blocking 1시간 primary 1:1000 1시간 wash 10분 3번 second 1:1000 1시간 wash 10분 3번 ECL 1분 측정 기계로 15분간 찍습니다 문제점들로는 1. 밴드가 얇은것 2. 전에 안보이던 non-specific binding이 보인다는 것 (항체 dilution 농도는 전과 같이 했는데 갑자기 보입니다) 3. membrane을 보면 모든 밴드에 끌림현상이 보인다는 것 4. protein을 30ug이상으로 well에 넣으면 이상하게 끌리면서 내려온다는것 5. 오른쪽에 뭔지모를 이상한 검정색 이정도입니다 제 생각엔 밴드가 얇은건 프로틴 양을 늘리면 되겠지만 늘리게 되면 4번과 같이 끌리는 현상이 있다는 겁니다 그렇다고 항체를 더 세게 하기에는 이미 non-specific binding이 보여서 그렇게 할 수는 없을꺼같고요 어떻게 고쳐나가면 좋을까요 조언 부탁드리겠습니다

안녕하세요, 현재 realtime PCR 세팅중입니다. 기기는 quantstudio 3 이며, 사용을 안한지 4~5년 되어가지고 지금 다시 세팅중입니다.   기기 자체적으로 calibration을 하라고 알림이 떠가지고 Thermo의 calibration kit (50만원 상당) 를 구매신청 해놓긴 했습니다. 배송 기다리는동안 일단 실험을 했는데 (SYBR 사용), CT값이 GAPDH 기준 20 언더로 잘 떴는데, 결과 해석을 해보면 그룹간 차이가 별로 나타나질 않더군요..  다른 실험적 문제일 수도 있지만 완전 다른 실험에서도 차이가 없는거로 봐서는 기계 calibration 문제인것 같은데.. calibration 차이로 인해서 결과 차이가 없어보일 수 있나요?  

안녕하세요.   지질 시료를 유기용매(t-butyl alcohol, bp 25도)에 녹인 후 동결건조 시켜 lipid mixture를 얻고자 합니다.   저의 동결건조 과정은 다음과 같습니다.   1) lipids in t-butyl alcohol을 deep freezer에 얼린다 (-80도, overnight)   2) 동결건조기 (HC3110) 에 넣어 건조시킨다 (-110도, overnight)   여기서 두가지의 질문이 있습니다.   1) 보통 동결건조 후 결과물은 솜사탕 재질의 power 처럼 나오던데, 가끔씩 vial의 바닥에 눌러붙은 기름덩어리(?) 처럼 생성될 때가 있습니다. 후자처럼 나오는 경우 동결건조가 제대로 되지 않은 것일까요?   2) 이론적으로 동결건조는 동결-1차건조-2차건조 를 거친다고 알고 있습니다. 2차건조는 1차건조 후 감압상태를 유지시키면서 온도를 올려서 남은 수분을 날려주는 과정인것 같은데, 제가 수행한 protocol은 1차건조까지만 하는것 같은데요. 보통 이렇게까지만 해도 실험실에서 했던 결과물은 잘 만들어졌습니다. 이럴 경우 2차건조는 따로 하지 않아도 괜찮은건가요? 만약 2차건조를 한다면, 감압상태에서 온도를 올리는 공정은 어떻게 진행하면 되는걸까요..?   추가적으로, 저희가 가지고 있는 동결건조기 (HC3110)은 전원을 키면 바로 -110도까지 쭉 떨어지던데, 원래 동결건조기들은 온도 설정하는 기능이 따로 없이 바로 최저온도까지 쭉 떨어지는 걸까요?   고수 연구자 선배님들의 답변 부탁드립니다 ㅠㅠ!! 감사합니다.

 안녕하십니까 면역학 lab실에서 실험하고 있는 학부생입니다.  뭔가 PCR 경험치가 부족해서 생긴 간단한 의문 같아서 질문부터 드리고 아래에 실험 조건 적겠습니다.   연두색 밑줄 친 경우를 어떻게 해석해야할지 궁금합니다. - 밝고 잘 나온 밴드들에 비해서 단순히 DNA 양이 적은 것인지 - 그렇다면 ladder 제일 밑 밴드(250bps) 보다도 아래에 있는 밴드의 정체는 무엇인지     실험 조건 - Raw 264.7 (from murine leukemia)에서 total RNA extraction 후 cDNA 합성 - 위 gel 사진은 target gene qPCR 전에 normalize 위해 진행한 beta actin PCR의 전기영동 - 전기영동 : 1% agarose, TAE buffer, 110V, 25min, 1kB DNA ladder    감사합니다.

안녕하세요! 마우스 비장 세포로 면역 실험을 준비 중에 있습니다. Phospho-NF-κB p65 안티바디를 구입하려고 합니다. Phospho-NF-κB p65, Phospho-NF-κB p65(Ser276), Phospho-NF-κB p65 (Ser536) 이렇게 세가지가 뜨는데 세 가지의 차이를 잘 모르겠습니다..  차이점에 대해 알려주시면 정말 감사하겠습니다ㅠ.ㅠ   (276은 erk 활성화에 관여하고 536은 akt 활성화에 관여한다고 하는데 면역실험 논문을 봤을 때, Phospho-NF-κB p65 안티바디를 많이 쓰시는 것 같은데 세 가지의 차이점을 정확하게 알고 싶습니다..)    

안녕하세요 HEK 293T cell line에 plasmid를 형질감염 시킨 후 배지로 분비되는 단백질을 정제하는 실험을 하고 있습니다.   Transfection 후 주로 48h~72사이에 수집하여 실험에 사용한다고 들었습니다. 그런데 HEK293T 세포 특성상 빼지가 하루만에 주황색으로 변해서 이때 배지를 수집해주고 새배지를 넣어줘야할지, 아니면 배지가 주황색인 상태로 계속 분비단백질을 축척하고 수집하는 지 궁금합니다.   배지가 노란색이 되면 분비 단백질에 영향이 생기고 HEK세포 컨디션에도 문제가 있어 발현에 문제가 생길껏이라고 생각됩니다. 그대로 놔둬야 할까요?   매번 어류 세포만 만지다가 인간 세포주는 처음이라서.... 혹시 HEK 293세포에 형질감염 실험 하시는 분들의 의견이 궁금합니다.   바쁘신데 긴글 읽어주셔서 감사합니다.

Telomere 관련 실험을 하고 있습니다. 현재, 육안으로 Hela cell의 상태가 100파이 dish 기준으로  100% 정도 confluency가 보이는 것 같은데  한번 더 culture을 해야 할까요? 아니면 cell harvest 해서 실험을 해도 될까요? 

안녕하세요 사수없이 혼자 프로젝트를 이끌어가고 있는 신입생 입니다 ㅜㅜ 제가 cell lysis 을 하는데, lysis buffer 에 NaBh4을 20mM 넣어주는데, 넣어주면 색깔이 갈색으로 변합니다... 그리고 잔거품이 엄청 생깁니다!!!! lysis buffer 조성은 50mM Tris-HCl(pH7.6) + 8M Urea + 1% Triton X-100 + 1X protease inhibitor + 1X phosphatase inhibitor 입니다. NaBH4 은 0.5M stock(in 0.1M NaOH) 을 만들어 씁니다. Tris-HCl 은 원인이 아닌 것 같은게 그것 대신 Ammonium bicarbonate 을 써도 똑같이 갈색이 되고 잔거품이 엄청 생깁니다.. 그렇다면 Urea 때문일까요? 그런데 아무리 구글링해봐도 안나오네요 ㅜㅜ 그리고 잔거품이 생기는것도 이상합니다 ㅜㅜ NaBH4가 물이나 HCl 만나면 수소기체가 생긴다는 것은 알고있는데 그건 뽀글뽀글 큰 기포방울 같은데 지금 생기는건 엄청난 잔거품?! 입니다..  잔거품을 떠나서 일단 색깔은 왜 갈색이 되는걸까요? 혹시 아시는 분이 있나요? 제발 약간의 정보라도 부탁드립니다!

위 논문이미지와 같이 TEM을 이용해서 cell 이미지 촬영을 하고싶은데.. 전처리하는 방법을 찾기가 어렵네요 ㅜㅜ 저희 공실관에서는 전처리를 못한다고 해서요 절편기기는 있다고 해서 고정,탈수,염색을 하면 될것같은 데 논문에도 안나와있어서 혹시 아시는 분 있을 까요?? 염색방법이 특히 궁금합니다..