[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
이엔셀
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
BioLab 장재봉 교수
전체보기 안전점검 LABox
 카테고리: 전체 > Molecular Biology-RNA > Northern Blot Analysis
Mol. Biol.-DNA Mol. Biol.-RNA Mol. Biol.-Protein Immunology
Cell Biology Microbiology Plant Biology Laboratory Animals
Omics Chemical biology Bioinformatics Laboratory Equipments
Buffer/Reagent Bioethics Etc.
카테고리 전체보기펼치기
질문/투표/프로토콜 등록
프로토콜 Northern blotting
Northern Blot Ⅰ.Label probe 1. preparation labeling of probe -> total 34㎕ (prepare 3 E-tube) -22~23㎕ dH2O -10㎕ random primer -25ng (1~2㎕) DNA 2. In RI room set - incubator @ 68℃, warm hybridization buffer - heat block @ 37℃ - turn cooker on (max temp)(boiling) - place RI @ RT 3.boiling mixed probe (34㎕) 5min -> spin down lightly   4.lay WYPALL, add - 10㎕ 5x dCTP buffer - 5㎕ 32P - 1㎕ Exo(-) Klenow (5v/㎕) ->pipetting 5. incubate labeled probe at 37℃ heat block 10min   Ⅱ. Pre-hybridization 1. input 5㎖ of hybridization buffer in a sealing bag ** pouring into backside of membrane. Don't touch membrane to the utmost 2. remove bubble -> 68℃ agitation (>15min) 3. put membrane upside down to completely remove bubble   Ⅲ. Filtration with column ** during that 10min, fill STE buffer in purification column using syringe. ** This procedure must be sequenced. 1. remove cap of column 2. put 1x STE (stored 4℃) 80㎕ 3. as pulling a piston, drive a screw of syringer at column 4. push a piston with feeling of solution move down. If leak.. it's OK! 5. put column RT as it stand until probe incubation finish 6. after 10min, add 2㎕ stop mix to probe 7. add probe (50㎕) to column 8. push a piston and collect flow-through to used E-tube 9. add 40㎕ STE buffer to column, collect to new E-tube 10. counter RI (100x)   Ⅳ. Hybridization 1. boil the probe 5min -> chill on ice 2min 2. add 20㎕ probe to 600㎕ hybridization buffer into a new E-tube 3. membrane: pour prewarmed buffer a little, add '2'mix to that, 4. fill hyb buffer,sealing and hybridize 68℃ with agitation for 2hr   Ⅴ. Washing 1. warm wash solutionⅡ at 68℃, turn 37℃ incubation on 2. pour wash solutionⅠ in plasic case 3. at waste room, carefully pour out, take membrane out with a pincette 4. soak wash solutionⅠ, incubation 37℃ 10min 5. during that time, prepare WYPALL and aluminium foil 6. after 10min, put membrane on foil 7. detect RI (100x) 8. discard wash solutionⅠ, repeat (pour Ⅰ again, 37℃ 10min-> detect) 9. soak membrane in warmed at 68℃ wash solutionⅡ 10. 37℃ incubation 10min, detect, repeat (W.SⅡ)-> detect 11. cover membrane with OHP film, put cassette, fix with tape 12. in dark room, cover a film on membrane -fit edge   Ⅵ. Exposing & Developing 1. expose -70℃ overnight 2. develop with develop machine
회원작성글 코스모스  |  2009.07.28
Q. 배지 Western시 basal 확인 어떻게 하는지좀;;;
현재 세포에서 배지로 방출되는 단백질을 western해야 합니다.근데 생각해보니 세포 자체를 lysis해서 western하는 경우에는b-actin같은 것들을 basal protein으로 사용하여서 정량로딩이 되었는지를확인하면 되는데 배지로 배출되는 것들은 어떻게 해야 하는지 모르겟네요;;;basal level확인 없이도 괜찮은건지.. 아니면 다른 방법이 있는건지...물론 로딩 전에 정량을 해서 제가 정량 로딩은 자신할수 있습니다만은...리뷰어들이 그걸 믿으려면 데이터가 필요하니까요.nothern을 하면될것 같은데 nothern은 해본적도 없고 저희 실험실이나 주변 실험실엔nothren하는 랩도 없고요;;;어떻게 방법좀 알려주십시오!!!
배지맨  |  2009.06.22
Q. northern blot (DIG) size marker
DIG northern blot 을 이번에 세팅하게 되었습니다. 아직 실험은 시작하지 않았고 이제 Roche northern starter kit 주문하고 필요한 시약 주문해 놓은 상태입니다. 다른 것들은 대부분 다 준비가 되어 가는거 같은데 하나 문제가 marker를 무얼 사용해야하는지 모르겟드라구요. 사는 거는 좀 비싼거 같아서 만들어 쓰시거나 사용하고 계신거 있으시면 어떤거 쓰시는지 좀 가르쳐 주세요. (RNA 겔, buffer 모두다 처음 만들어 보는 것이라 걱정입니다. 실험을 시작하게 되면 앞으로 더 많은 질문을 올리게 될것 같네요. nothern blot 실험하시는 분들 잘 부탁드립니다. ^^)
YN  |  2007.12.24
Q. RNA전기영동 후 밴드가 안 보여요...
nothern blotting을 하는데요 formaldehyde 겔에 10ug RNA를 전기영동했습니다 전기영동후 EtBr로 염색 후 밴드가 안 보입니다 RNA 분리 후 전기영동했을 때는 밴드가 있었거든요 2번이나 전기영동했는데 두 번 다 밴드가 안보여요 왜 그런지 알려주세요 ~~~
nothern  |  2007.03.08
Q. nothern 과 RT-PCR..??
nothern 과 RT_PCR 모두 그 target은 mRNA 인걸로 알고 있는데,, 그 차이가 뭔지...^^;; 그리고 왜 nothern으로 확인 하는지 ..?? 아시는 분 도움 부탁 드릴께요~^^
nothern..?..  |  2006.12.29
Q. RNA sample buffer 조성좀....
만들어서 사용하는데 조성에 별 문제가 없지 않나 싶은데 자꾸 RNA가 running후 degradation 되네요 조성이 final 5ml 에 formamide 2.5ml 10X MOPS 0.5ml glycerol 0.5ml formaldehyde 0.9ml DEPC H2O 0.8ml bromophenol blue 0.0125g 만들어서 ETBR 넣어 사용하거든요 보관은 -20도에서 하구요 혹 조성에 문제가 있다던가 좋은 sample buffer 조성을 알고 계시면 도와주세요~~ 한 열번 nothern 하다가 이제야 이게 문제인걸 확인했는데 해결방법이 없네요
이지연  |  2006.07.11
Q. nothern과 RT-PCR
노던과 rt의 차이점은 알고 있습니다만... paper를 찾아 보던중, 노던으로 rna가 발현되지 않음을 알고 같은 cell line을 구해서 rt를 해본결과 밴드가 상당히 많이 잡힙니다. 제가 control로 사용한 cell line(이 cell line은 nothern 발현이 상당히 많이 되어 있네요) rt가 노던보다 상당히 sensitive하여 자칫하다가는 상당히 짙은 밴드가 잡힌다고 합니다만... 노던에서조차 보여지지 않았던 밴드가, 노던에서 상당량 발현이 확인된 cell line에서보다 더 밴드가 진하게 나오는지... 설명좀 부탁드리겠습니다. rt의 목적에 부합하여 유전자 발현의 상대적 패턴을 보고자 함인데 당황스럽습니다. 제 실험계획을 노던 data를 바탕으로 계획해서 진행중이었는데 막상 rt를 하고보니 정 반대의 결과를 보여주고 있어서 어떻게 해석해야 할지 모르겠습니다. 도움 부탁드립니다. (노던 데이타가 실린 paper는 중상정도급의 paper입니다) - 다시 정리하자면, 노던에서 detection되지 않았음에도, RT-PCR 에서는 detection된다. 노던에서 과량 detection되지만, RT-PCR에서는 노던시 detection되지 않는것 보다 상대적으로 detection되는 양이 적다. 입니다.
석사생  |  2006.02.03
Q. nothern과 RT-PCR 차이
위 두방법의 차이가 있나요? 즉 RT-PCR로 하나 nothern으로 하나 그 결과는 마찬가지인가요? 아니면 무슨 차이가 있나요?
궁그미  |  2004.12.15
Q. Dig-labelling kit을 이용한 nothern blot~
isotope이 아닌 roche''s에서 취급하는 dig labelling kit을 이용한 nothern blot을 하려고 하는데 혹 이 kit을 이용해서 실험하시는 분 답신 주십시요. 종류가 많아서 어떤 걸 사용해야할지 , 그리고 국내 roche취급 시약상이 어딘지 알 수가 없군요. roche hompage에 나와있는 전화로 연락을 해보면 연결이 안되는 군요. 그리고 isotope 만큼 실험 결과가 잘 나오는지... 이런 방법을 사용하여 실험하시는 분 답신 부탁 합니다.
pmy  |  2001.06.23
Q. mRNA 발현량을 알려면.......?
nothern 을 통하여 mRNA의 발현량을 보고자 합니다. standard로 쓸 mark가 어떤것이 있나요? 참고로 target은 1.7kb정도의 DNA가 식물에서 발현되어 얻은 mRNA입니다. 아시는 답변 부탁드립니다.
bak  |  2001.04.20
이전  01 02 3  다음
실험 회원 등급이란?
실험Q&A 회원등급안내
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
필코리아테크놀로지 광고