제목대로 사진을 보시면 PAGE를 직접 만들어서 쓰는데 가끔 가운데 or 다른 구간에 일자의 선이 생깁니다. 이 선이 생깁니다. 원인을 찾고있는데 어려워서 조언 구합니다 ! 

안녕하세요 RNA와 protein의 interaction을 보고자 RNA pull down assay 실험중입니다. 현재 RNA와 protein을 서로 reaction 시켜준 다음, non specific protein을 제거시키기위해 wash buffer(100mM KCl,20mM Tris...등등)로 wash를 하고있지만 non specificity가 제거되지 않는 것 같습니다. 이에 대한 트러블슈팅으로 salt의 농도를 다르게해주어서 문제 해결을 하려고하는데 Salt의 농도를 높여줘야할까요? 아니면 낮춰줘야할까요? (RNA-protein interaction은 hydrogen bond로 되어있어 이 결합을 단단하게 해주려면 ionic strength가 필요하다는 것까지 알고있습니다. 그래서 salt의 농도를 낮춰주면 정말 온전한 hydrogen bond를 이루고있는 protein만을 얻을 수 잇다고 생각되어지는데 맞나요?) 답변부탁드립니다 선배님들 ㅠㅠ!!!

Protein interaction에 대해 알아보기 위해 Pull down assay 잔행중입니다. Buffer조성 중에 100mM KCl이 들어가있는데 1) 이정도는 high salt라 보나요? 아니면 low salt로 보나요? 2) 근데 salt가 protein에 어떤 영향을 주는건가요?

안녕하세요 대학원 석사 1학년입니다. 다름이 아니라 Bradford assay 실험을 하고 있는데 의문이 듭니다. 현재 Bio-rad bradford 1X 시약을 사용하고 있는데 프로토콜은 BSA 농도를 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4로 Total volume 50uL에서 3uL씩 따서 96well에 3반복으로 넣고 Brandford 시약을 멀티피펫으로 100uL씩 넣습니다. 근데 R^2값이 0.99정도가 나오지 않고 0.95 위로 나옵니다.  단순 파이펫팅 문제인지 잘 모르겠습니다. 그리고 또 궁금한거는 다른 글들을 찾아보니깐 BSA샘플과 시약을 섞은 다음 volexing해서 3반복으로 하는 방법이 있던데 따로 넣는것과 미리 섞은 다음 넣는것에 어떤 차이가 있을까요..? 알려주시면 감사하겠습니다(꾸벅)

GST에 hEPO 유전자가 Tag 되어있는데 pull down assay를 실시후 western blot 수행하려고 하는데요   pull down에 쓰이는 bead만 따로 구매할 수 있을까요? 그리고 hEPO가 연결되어있는 GST를 Pull down 할 경우 어떤 종류의 bead를 사용해야하나요? kit 추천 부탁드립니다.

Co-IP 실험 관련해서 질문드립니다. 현재 박사수료생이고 molcular biology 쪽으로 실험을 주로 하고 있는데 (fluorescence protein 이용한 confocal- colocalization analysis, western blot, Y2H and BiFC 등) 제가 연구하고 있는 단백질 A와 B가 Y2H 에서 결합하고, in vivo BiFC 상에서도 결합하는 것을 보았습니다. 두 실험 모두 3번 이상의 반복을 통해 확인이 되었습니다.  다만 두 단백질을 발현하는 stable expression line을 얻어, colocalization analysis 을 진행하였을 때는 어느 조건에서도 쉽게 겹치는 것을 확인하기는 어려웠으나, 두 단백질을 코딩하는 gene mutant 를 얻어서 double mutant analysis 를 통해 epistatic-genetic interaction은 확인하였습니다. 다른 또다른 단백질 c와 complex를 이루는지 보고 싶었기 때문에 최근에 invivo co-ip 셋팅을 하게 되었는데요. co-ip 상에서는 단백질 A와 B의 결합을 보기가 어려웠습니다. Co IP setting은 먼저 보고자하는 단백질 A,B 에 각 GFP, Myc tag를 붙혔습니다. (tag protein에 대한 funtional 문제는 mutant complementation을 통해서 확인되었습니다. 물론..interaction에 영향을 무시하지는 못하나, endogenous antibody가 없습니다). 그 후, cell에 transient expression을 통해 발혔시켰고, 발현이 잘 되는 것을 확인하였습니다. lysis buffer  : 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5% Glycerol, 0.5% Triton-X 100, 2 mM PMSF, 1x protease inhibotor cocktail (roche), pH 8.0 조성으로 사용하였고, proteinA 로 먼저 precleaning 후, bead-antibody를 처리하여 저온 (4도) 에서 2시간 gentle shacking 하여 끌어당겼습니다. 당기는데 사용한 bead-antibody는 bead에 myc antibody가 이미 붙혀져 나온 제품을 사용하였습니다 (agarose bead-proteinA-Myc antibody). 최종적으로는 2x sample buffer (containing 2-ME) 를 이용하여 elution 하였습니다. 현재 2번 정도 반복하였는데, 동일한 결과를 얻고 있네요. 질문은 1. lysis buffer 상의 조성이 불필요하거나, 불충분한 부분에 의해  interaction에 영향을 주는게 있을까요? 2. weak interaction, transient interaction 을 한다면 co-ip로 잡기 어려운걸까요? 3. 그 외에 다른 원인이나 주의해야할 점 생각나는 부분이 있다면 의견 주시길 바랍니다.

흡광도 보정값은 양수이지만 단백질의 양을 계산하였을 때 음수가 값이 마이너스 값이 나올때는 어떻게 해야하나요..?

단백질 정량 실험에서 흡광도의 보정값이 마이너스 값이 나왔을 경우에는 단백질의 양을 어떻게 계산해야하는 것인가요?

안녕하세요.   IP 실험 세계로 막 진입한 초보자입니다. 연구를 하다보니 제가 연구하는 단백질이 어떤 단백질과 상호작용할 것같다는 의심이 들어서 Immunoprecipitation(IP) assay를 진행하게되었는데요. X라는 단백질과 CH25H 라는 단백질이 상호작용하는 지 확인하기 위하여 IP로 X를 떙겨서 IB로 CH25H를 찍어 보았는데요..   결론적으로 사진에 보시는 것 처럼, input, supernatant 의 sample과는 다르게 IP sample에서는 단백질 사이즈가 높은 곳에서 detection이 됩니다.. 이게 이론적으로 가능한 현상인가요? 저나 저희 지도교수님이나 IP를 처음 해보는 터라 이러한 현상이 가능한 것 인지 전혀 감이 안오네요.. (위 아래 사진은 명암? 조절을 해서 보여드린것이고, 같은 사진입니다)   IP 고수 선배님들의 조언을 부탁드립니다..ㅎㅎ  

Bradford assay 실험에서 coomassie blue가 protein에 binding하는 정도에 따라서 흡수 파장이 변하는 것으로 알고 있는데,  coomassie blue의 구조적인 측면에서 왜 그렇게 되는지 유기화학 기반의 답변을 듣고 싶습니다.

생화학 실험 전반에 걸쳐서 단백질 정량이 갖는 의의와 어떤 목적으로 단백질을 정량하는지 알고싶습니다.

TCA DOWN 에서 sds-page 내리기 전  sample Buffer 넣은 후 5분동안 끓이는 이유가 뭔가요?   그리고 전기영동시에 running gel 부분에서 80V로 내리다가   Stacking gel 부분에서 120V로 올리는 이유도 궁금해요.

제가 실험하고 있는 단백질이 pI값 5.7입니다. pH 7.8에서 net charge (z)를 알아보니 값이 -8.0이 나왔는데 이게 무슨 의미인가요? pH 7.8에서 단백질 한 분자에 전자가 양성자보다 8.0개 더 많이 있다는 얘기인가요??

겨수님이 어떤 유전자에 대한 cytokine array 분석을 해오라고 하셨는데요 tcda data 분석처럼 어디 사이트에사 볼 스 있나요??

안녕하세요 제가 pH 7.8에서 DEAE resin에 binding하는 protein 최대량을 구하려고 하는데요 resin 설명서를 읽으니까 capacity가 0.11~0.16mmol/ml resin이라고 되어있고 제가 가진 단백질은 pH 7.8에서 net charge (z)가 -8.0으로 나왔습니다 pI 값은 5.7이고요 아미노산은 154개, size는 15925.72 Da이 나왔습니다   resin ml에 붙는 단백질의 최대 mg을 구하고 싶은데 어떻게 계산해야할지 모르겠습니다 방법 좀 알려주세요 ㅠㅠ