안녕하세요. ICC 처음 진행하게 돼서 그와 관련하여 여쭤볼게 있습니다.   약물의 시간별 처리에 따라 Mitochondria에서의 2가지 항체가 co-하는지 확인하고자 하는데요.   Q1. Blocking 후에 1차항체 A (Host M) 와 1차항체 B (Host R)를 처리할 때,    1) 1차항체 A 넣고, RT 1hr and washing 후 B넣고 RT 1hr and washing        또는    2) A와 B를 같이 넣은 후, 4도 O/N 후 washing       어떤 방식으로 하는게 좋을지요?   Q2. 2차항체도 A와 B에 대해서 시간을 두고 넣어야할까요, 아니면 동시에       넣고 진행해도 상관없을까요?   Q3. 위의 1차와 2차 항체 붙이는 과정 끝난 후에 mito-tracker로 최종 염색         하면 될까요?   답변해주시면 고맙겠습니다 :)  

IHC할때 Antigen retrival 시에 95"로 끓이잖아요   이때 전에 한번 끓인 citrate buffer 재사용 가능한가요?

  PBMC 분리과정에서 마지막 washing 하고 cell down 후  상층액 석션할때 suction기의 흡입력이 약해서, 상층액을 그냥 따라버려도 괜찮을까요? cell들이 많이 떨어져 나갈까요? 허접한 질문 죄송...  

B cell과 T cell의 상호작용에 대해 아시는 분 있나요 교수님께서 문제를 주셨는데 Th cell과 B cell의 상호작용은 알겠는데 T cell과의 상호작용은 잘 없네요 ㅠㅅㅠ T cell안에 Th cell이 있다는건 알겠는데 교수님이 T cell과의 상호작용을 물어보셔서,,,, 도와주세요!

아무 처리도 하지 않은 RAW 264.7 cell도 griess 시약 투여시 분홍색으로 변했다면 cell의 어떤 점이 문제가 생긴 건가요?

griess assay에서 griess A 시약과 griess B 시약을 시험 직전에 섞어주는 이유가 있나요? (미리 섞어놓고 쓰지 않는 이유)

Primary antibody : F4/80 Antibodies, Bio-rad, MCA497G Secondary antibody : Goat anti Rat IgG2b:HRP, Bio-rad, STAR114P Vectastain : ABC KIT, Vector labs, PK-6100 DAB : DAB Quanto, thermos scientific, TA-125-QHDX 사용하였습니다 Liver 조직슬라이드 deparaffinzation 후 antigen retrieval 후에 블록킹> 3% h202 10min, goat serum 20min incubate 하였습니다. Primary antibody : F4/80 Antibodies, Bio-rad, MCA497g로 24시간 o/n 하였습니다. 다음날 Vectastain : ABC KIT, Vector labs, PK-6100 으로 30분 incubate 후에  Secondary antibody : Goat anti Rat IgG2b:HRP, Bio-rad, STAR114P 부착하였습니다. Scientific Ultravision Substrate Detection System (DAB) 처리 후 hemotoxylin 염색하고 마운팅하여 확인하였는데 호가인이 안됩니다. 무슨 문제인지 알고싶습니다. 키트들은 전부 새거로 사용하였습니다.

EDTA tube에 혈액 채취후 PBMC를 분리하려 하는데 1. 혈액 채취 후 몇시간이내까지 안정성이 있나요?여건상 샘플을 모아서 오전/오후 분리를 하려하는데 yield가 많이 차이나는지 궁금합니다.분리 된 PBMC로 CD34를 분리하거나, TCR sequencing, FACS 분석 등에 사용 하려합니다. 2. 또 PBMC 분리 전 혈액 샘플 (EDTA) 보관 온도도 궁금합니다. (냉장보관인지 상온보관인지)3. 또 헤파린 튜브가 아닌 EDTA 튜브의 PBMC분리 안정성도 궁금합니다. 답변 부탁드립니다.

ICC 실험하시는 석사/박사 분들 혹시 ICC 용으로 사용하시는 과산화수소수가 뭔지 답변 부탁 드려도 될까요?

안녕하세요 저희실험실에서 brdu double staining을 진행하려고 하는데,BrdU랑 NeuN double staining으로 갈 것같습니다.저희가 받은 프로토콜에는 Primary rat anti-BrdU antibodyCy3-conjugated goat anti-rat antibodyblockingNeuNFITC conjugated donkey anti-mouse antibody이 순서로 붙이던데 Cy3-conjugated나 FITC대신 alexa를 사용해도 되나요?

폐섬유화 조직관련 masson stain이나 goldner masson stain 해주실 대행업체 찾습니다.저희가 웨이거 헤마톡실린이 없어서 부득이하게 제가 못하게 되었어요..참고로 지역은 서울입니다. 폐와관련해서 조직염색해주실 업체를 찾습니다.밑에 답변 부탁드려요 실시간 확인하겠습니다. 

Immnunocytochemistry를 종종 하고있는데요소속되어있는 곳이 대학병원이긴하나 따로 confocal도 없고 약대, 바이오캠퍼스에 있긴한데 세팅이 안되어 있다고 해서요ㅜㅠ매번 졸업했던 대학원가서 이용하기도 너무 멀고 힘들기도 해서요ㅠ경기도, 서울쪽에 외부인이 confocal 이용할 수 있는 곳 아시면 알려주세요!!ㅜ

안녕하세요 이번에 ICC 실험을 처음하게 되었습니다.인터넷에서 프로토콜을 많이 찾아보고 시도하고 있는데,,, 제대로 찾아서 하고 있는지,,, 혹시 직접 선생님들이 하고 계시는 프로토콜들을 알수가 있을까해서 질문올립니다,,

ICC 결과 현미경 사진 첨부드립니다.DAPI는 이런일이 발생되지 않는데Alexa488만 이러한 Paticle이 발생됩니다.원인 분석을 위해 실험 조건을 적어드립니다.protocol - cell seeding / remove media  / fixation(Methanol+Acetone, 4'C 20분) / blocking 1hr / sample infection (4'C o/n) -  sampel remove / 1st Ab 1hr, 1:1000, RT / 2nd Ab 1hr 1:2000, RT, Dark / DAPI 1min // mounting1. 각 과정 사이의 "/"에는 1X PBS로 10분씩 3번 washing 하였습니다. (shaker rpm 90)2. Fixation solution이 methanol이라 따로 detergent는 추가하지 않았습니다.3. 1st Ab ab9225, 2nd Ab ab150113 DAPI 1:10000(1ul/10ml) in PBS4, mounting sol -Dako S3023

제목 그대로인데요 한번썼던 키트를 다음번에 다시 사용해도되나요? 샘플이많아서 키트가 훅훅 나가네요 가격도 한개당 36만원이구... 설명서엔 별다른말은없네요 pk6100쓰고있습니다

안녕하세요!! 제가 IHC 염색을 더블로 하려고 하는데, 2개의 항체의 host가 같아요ㅠㅠ2개의 항체를 더블 염색 할 수 있을까요??? 혹시 할 수 있다면 어떤 방법으로 하면 될까요??ㅠㅠㅠ석사로 들어온지 두 달 정도 밖에 안되서 모르는게 너무 많아요ㅜㅜㅜㅠ 도와주세요ㅠㅜㅜㅜㅜㅜ 부탁드립니다ㅠㅠ

뇌조직에서 IF(immunofluorescence)를 진행할려고합니다. 질문 : 1차붙이기전 PROTOCOL 을 구하고싶습니다. 정말 전문적으로 하시는분들 프로토콜 부탁드립니다. 공개안하겠습니다. ymxki@naver.com 으로 보내주시면 감사하겠습니다.ㅠㅠ 꾸벅 질문 2 : 저희가 손상된조직에도 if 를 염색하는데 그 손상된 조직에도 형광이 너무 심하게 먹어             같은 섹션 비손상 조직이 대조적으로 시그널이 약하게 찍힙니다. 그 손상부위 부분을 좀 약하게 하는 방법이 없을련지요..   질문3 : 프로토콜중에 셀이 아닌데 전 조직에서 하거든요.. FBS로 블럭킹하는데 이렇게 해도될까요? 존경하는 선생님들.. 세가지중 하나라도 답변해주시면 정말로 감사하겠습니다. 부탁드립니다.  

혹시 peritoneal macrophage로 FACS 해보신 분 계신가요~~?mice에 4% thioglycollate를 i.p로 injection 한 후 4일 후 sacrifice했습니다.dish에 cell을 깐 후 1hr동안 incubation 한 후에 바닥에 붙은 cell들을 pMa로 간주하고 실험을 진행했습니다. (위에 떠다니는 cell을 wash-out)복강 내에서 pMa를 collect해서 FACS를 찍어봤는데총 3개의 population이 나왔습니다.이론적으로는 1개의 population이 나와야 할 것 같은데 원인이 무엇일까요?제가 예상하기로는1. cell debris가 제대로 wash되지 않음.2. cell 수가 너무 적음 (30000만개 counting)3. 1hr incubation 한 후 cell morphology를 관찰했을 때, 동글동글한 cell도 있고 간혹 삐죽삐죽한 별모양 cell도 있었는데 거기에서 오는 차이?정도 예상을 해볼 수 있었는데, 혹시 관련 실험 해보신 분 있으면 조언 부탁드립니다.참고로, 중간에 있는 population을 잡았을 때 제가 원하는 대로 결과가 나왔습니다.  

안녕하세요 실험중에 궁금한 부분이 있어서 질문을 올리게 되었습니다.ICC staining시 IgM type의 1차 antibody를 IgG type의 2차 antibody가 인식할 수 도 있나요? (둘다 mouse antibody입니다.)떠서는 안되는 signal이 보이는데 이런 이유인가 해서요..

IHC 에  사용될 항체를 주문하려고  합니다. 카탈로그에 100ul 부터 7ml 까지 다양한 용량으로 나와있어서 고민입니다파라핀블락 슬라이드 100장에  필요한 항체양은 얼마로 예상할지요 스탁을 100배 dilution 한다면 대략얼마나 필요할까요?